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研究目的:难治性间质型肿瘤细胞对铁死亡诱导剂敏感。然而,其调控机制仍不明确。糖脂代谢是间质型肿瘤细胞治疗抵抗的关键因素,本研究旨在探讨糖脂代谢在间质型肿瘤细胞铁死亡中的作用及其潜在机制。研究方法:(1)CCK-8试剂盒验证不同培养条件下Erastin和RSL3对人胰腺癌细胞(PANC1,PaTU8988)活性的作用;丙二醛法(MDA)检测葡萄糖浓度梯度降低处理条件下Erastin处理后PaTU8988细胞内脂质过氧化水平。免疫印迹法(Western blot)检测PANC1和PaTU8988细胞内铁死亡指标及O-GlcNAc糖基化表达水平。(2)构建稳定干扰GFPT1或OGT的PANC1和PaTU8988细胞株,Western blot验证干扰效率及铁死亡指标表达水平;MDA试剂盒检测相应细胞内脂质过氧化水平;CCK-8试剂盒检测不同处理条件下抑制O-GlcNAc糖基化修饰的胰腺癌细胞对铁死亡诱导剂敏感性。(3)通过KEGG富集分析敲除OGT胰腺癌细胞内差异基因分布情况;TCGA数据库分析O-GlcNAc糖基化修饰相关分子与EMT相关转录因子之间的相关性。(4)在PANC1和PaTU8988细胞中稳定干扰ZEB1,Western blot验证干扰效率及铁死亡指标表达水平;MDA试剂盒检测相应细胞内脂质过氧化水平;CCK-8试剂盒检测干扰ZEB1及外源性添加UDP-GlcNAc后间质型胰腺癌细胞内相对细胞活性。(5)免疫荧光(IF)及免疫共沉淀(Co-IP)鉴定PANC1和PaTU8988细胞中ZEB1蛋白上发生 O-GlcNAc 糖基化修饰;Western blot 及 RT-qPCR 检测 PANC1 和 PaTU8988 细胞干扰OGT后ZEB1蛋白及mRNA表达水平。(6)YinOYang 1.2预测ZEB1 O-GlcNAc糖基化修饰位点并通过Co-IP验证;CCK-8及MDA试剂盒检测转染ZEB1-WT及ZEB1-S555A质粒后的PANC1和PaTU8988细胞内的相对细胞活性及MDA水平。(7)Western Blot及RT-qPCR 不同处理条件下 PANC1 和 PaTU8988 细胞中 ACLY,ACSS2,FASN,SCD1 和 FADS2 蛋白及 mRNA 表达情况。(8)双荧光素酶报告实验检测ZEB1-WT和ZEB1-S555A与FADS2启动子在HEK293T细胞中的转录活性;CCK-8检测FADS2抑制剂SC-26196联合铁死亡诱导剂处理48 h后PANC1和PaTU8988细胞的相对细胞活力。(9)鼠源性PANC02细胞用PBS或Thiamet-G预处理2周后在C57BL/6J小鼠中构建皮下瘤模型,每隔一天在肿瘤周围注射piperazine Erastin治疗小鼠,并测量肿瘤体积,持续2周;实验结束后取出肿瘤组织,称重,并运用MDA、免疫组化(IHC)及Western blot检测脂质过氧化相关指标。(10)运用生物信息学方法和IHC对胰腺癌组织及癌旁组织中O-GlcNAc糖基化修饰相关分子表达水平和临床意义进行分析。研究结果:(1)CCK-8结果显示:Erastin、RSL3可以诱导人胰腺癌细胞(PANC1、PaTU8988)发生铁死亡;葡萄糖饥饿可以挽救Erastin和RSL3诱导引起的细胞死亡;MDA结果显示:葡萄糖浓度梯度降低可以抑制Erastin引起的MDA水平上调。Western blot结果显示:随着葡萄糖浓度降低,PANC1及PaTU8988细胞中SLC7A11表达升高,O-GlcNAc糖基化修饰表达水平下调。(2)Western blot 结果显示:干扰 GFPT1或OGT的PANC1 和 PaTU8988 细胞中 GFPT1或OGT表达水平下调,提示质粒构建成功;各项处理均可显著调控PANC1和PaTU8988细胞中O-GlcNAc糖基化修饰表达水平,提示干扰质粒及抑制剂有效。MDA及CCK-8结果显示:在PANC1和PaTU8988细胞中干扰GFPT1或OGT可以显著抑制Erastin引起的MDA水平上升及细胞活性降低;小分子抑制剂DON和BADGP可以挽救Erastin引起的细胞活性降低;TMG可以协同Erastin杀伤PANC1和PANC02细胞。(3)KEGG富集分析结果显示:敲除OGT的胰腺癌细胞差异基因富集在转录因子活性集上;TCGA数据库分析结果显示:只有转录因子ZEB1与GFPT1、OGT呈显著正相关。(4)CCK8、MDA及Western blot 结果显示:干扰ZEB1的 PANC1 和 PaTU8988 细胞对铁死亡抵抗;UDP-GlcNAc协同Erastin和RSL3抑制干扰ZEB1的胰腺癌细胞活性。(5)IF及CO-IP结果显示:PANC1和PaTU8988细胞ZEB1蛋白上发生O-GlcNAc糖基化修饰;Western blot及RT-qPCR结果显示:干扰OGT可以抑制PANC1和PaTU8988细胞中ZEB1的蛋白表达水平,对ZEB1的mRNA表达无影响。(6)YinOYang 1.2预测结果显示:ZEB1上Thr678及Ser555位点发生O-GlcNAc糖基化修饰的可能性最大;Co-IP结果显示:在PANC1及PaTU8988细胞中Ser555位点是ZEB1的O-GlcNAc糖基化修饰位点,而非Thr678位点;CCK-8及MDA结果显示:转染ZEB1-S555A质粒的胰腺癌细胞对铁死亡抵抗。(7)Western blot或RT-qPCR结果显示:葡萄糖浓度降低或干扰GFPT1、OGT条件下PANC1 和 PaTU8988 细胞中 ACLY,ACSS2,FASN,SCD1 和 FADS2 蛋白及 mRNA表达均下降。(8)RT-qPCR 或 Western blot 结果显示:干扰 ZEB1 或点突变 ZEB1(ZEB1-S555A)处理的 PANC1 和 PaTU8988 细胞中 ACLY、ACSS2、FASN、SCD1 和 FADS2 的mRNA及蛋白表达水平均下降;双荧光素酶报告实验结果显示:与ZEB1-WT相比,ZEB1-S555A与FADS2启动子在HEK293T细胞中结合减少;CCK-8结果显示:SC-26196抑制Erastin和RSL3引起的PANC1和PaTU8988细胞活性降低。(9)体内实验结果显示:与单用piperazine Erastin相比,Thiamet-G预处理组联用piperazine Erastin可以显著抑制小鼠皮下瘤体积;MDA、IHC及Western blot结果显示:与PBS预处理组相比,Thiamet-G预处理组脂质过氧化相关指标显著上调。(10)生物信息学和IHC结果显示:胰腺癌组织中O-GlcNAc糖基化修饰相关分子及ZEB1的表达水平显著高于癌旁组织;高表达O-GlcNAc糖基化修饰相关分子及ZEB1的胰腺癌患者预后更差。研究结论:(1)葡萄糖介导的O-GlcNAc糖基化促进间质型胰腺癌细胞铁死亡。(2)ZEB1 S555位点O-GlcNAc糖基化修饰调控ZEB1蛋白稳定性及葡萄糖介导的间质型胰腺癌细胞铁死亡敏感。(3)ZEB1 S555位点O-GlcNAc糖基化修饰转录水平促进FASN-FADS2轴调控的多不饱和脂肪酸合成,最终导致脂质过氧化依赖的间质型胰腺癌细胞铁死亡。