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在大肠杆菌、沙门氏菌、结核杆菌、霍乱弧菌和铜绿假单胞菌等许多病原菌中,MarR6、GntR10和ArsR6在转录后水平调控基因的表达,并在毒力调控中发挥重要作用。布鲁氏菌转录因子MarR6、GntR10和ArsR6作用机制还没有进行深入研究。本论文,通过生物信息学、多克隆抗体的制备、染色体免疫共沉淀试验等,发现MarR6、GntR10和ArsR6转录因子调控的下游靶基因,并对以上三种转录因子相应的靶基因进行功能研究。目的:(1)构建流产布鲁氏菌2308(S2308)的MarR6、GntR10和ArsR6基因缺失突变株。(2)制备布鲁氏菌MarR6、GntR10和ArsR6的多克隆抗体并纯化。(3)染色体免疫共沉淀技术和Ch IP-Seq筛选出靶基因,研究其生物学功能。方法:(1)分别扩增目的基因的上下游同源臂和卡那基因,运用融合PCR融合三段基因并连接PMD19-T载体,通过同源重组互换亲本株基因组中的目标基因,检测其生长特性,用三个缺失株分别侵染小鼠巨噬细胞(RAW264.7),并检测其胞内存活情况和炎性细胞因子的分泌情况。(2)采用生物信息学方法,选择目的基因合适的片段,运用PCR扩增目的片段,连接PMD19-T载体酶切后,构建重组表达质粒PGEX-4T-1-MarR6、GntR10和ArsR6,转化到E.coli BL21(DE3)中后用自诱导培养方法表达蛋白,经SDS-PAGE鉴定后纯化蛋白,用纯化的重组蛋白皮下多点注射的方法免疫实验级日本大耳白兔,测定其血清效价,用亲和层析法进行抗体纯化,LOWRY法测定抗体蛋白含量,间接ELISA试验测定效价,Western-blot检测抗体特异性。(3)先将细菌用甲醛处理,超声破碎,后用染色体免疫共沉淀(Chip)技术,得到富集的靶蛋白-DNA复合物解交联,纯化富集的DNA片断PCR分析。运用ChIP-Seq技术分析后,并提取S2308、MarR6、GntR10和ArsR6缺失株的RNA进行RT-PCR筛选低表达的靶基因;采用同源重组互换亲本株基因组中的目标基因,检测其生长特性,用缺失株侵染小鼠巨噬细胞(RAW264.7)并检测缺失株BAB_RS21490在胞内存活和细胞因子分泌情况。结果:(1)成功构建缺失株MarR6、GntR10和ArsR6,至少稳定遗传15代,生长趋势均在14 h达到对数生长期,24 h进入平台期且与亲本株无显著差异。胞内存活情况实验中:ArsR6和MarR6缺失株在侵染细胞12 h时显著低于亲本株,GntR10缺失株在侵染细胞4 h和12 h时显著低于亲本株。三个缺失株和亲本株在0 h,4 h,12 h和24 h时四个侵染组TNF-α和IL-1β的分泌量均高于PBS对照组,ΔGntR10组在侵染4 h和24 h时TNF-α的分泌量极显著高于亲本株;而ΔMarR6、和ΔArsR6与亲本株差异不显著。(2)运用生物信息学方法分析到MarR6、GntR10和ArsR6基因分别选取了255 bp、300 bp和228 bp,PCR扩增的位置与目标条带相符;自诱导表达和纯化后的SDS-PAGE显示MarR6、GntR10和ArsR6融合蛋白分别在34 KD、37 KD和32 KD处;效价可达到1:512000,Western-Blot检测出现杂交条带;蛋白含量分别为3 mg/L,2 mg/L和2.54 mg/L。(3)布鲁氏菌转录调控因子MarR6、GntR10和ArsR6的调控的靶基因分别为123、89和83个。成功构建BAB_RS21490缺失株且稳定遗传至少15代没有回复现象,生长趋势14 h时菌株都已到达对数生长期,到22 h到达细菌生长平台期与亲本株S2308生长趋势基本一致,胞内CFU计数试验中BAB_RS21490缺失株在侵染细胞4 h和12 h时显著低于亲本株S2308。IL-1β的表达量在缺失株感染4 h和12 h时显著低于亲本株S2308,感染24 h时极显著高于亲本株;TNF-α的表达量在缺失株感染0 h和24 h时显著高于亲本株2308,12 h时极显著高于亲本株S2308。结论:(1)成功构建并验证了布鲁氏菌MarR6、GntR10和ArsR6缺失突变株并且稳定的传至少15代,生长曲线显示生长趋势良好和亲本株没有显著性差异;缺失株布鲁氏菌在菌胞内存活能力减弱;缺失株GntR10侵染细胞后TNF-α和IL-1β的分泌增多,这为S2308的转录因子功能研究奠定了一定的基础。(2)成功克隆并表达S2308的MarR6、GntR10和ArsR6重组蛋白,表达的重组蛋白具有免疫原性,效价为1:512000,并制备了高纯度、高效价的多克隆抗体,为后期染色体免疫共沉淀建立奠定了基础。(3)筛选MarR6、GntR10和ArsR6的靶基因295个;其中GntR10的靶基因BAB_RS21490与S2308相比低表达。BAB_RS21490促进布鲁氏菌的胞内存活,抑制炎症因子IL-1β和TNF-α的分泌。综上所述:本研究成功构建并验证了布鲁氏菌MarR6、GntR10和ArsR6缺失突变株并且传至15代后并未发生突变;胞外生存能力与亲本株无显著性差异,胞内存活能力下降;克隆并表达S2308的MarR6、GntR10和ArsR6重组蛋白,并制备了高纯度、高效价的多克隆抗体;布鲁氏菌转录调控因子MarR6、GntR10和ArsR6的调控的靶基因分别为123、89和83个;布鲁氏菌侵染巨噬细胞后,GntR10可以通过上调BAB_RS21490基因表达量,抑制细胞炎症因子TNF-α和IL-1β的释放,从而抑制了炎症的发生。