在生命科学研究和生物制药、生物制品的生产中,利用表达载体制备重组蛋白是重要而关键的环节,获得足够量的重组蛋白是进行后续研究和生产的必要条件。构建有效的表达载体是表达目的基因的基本要求,同时也是影响基因表达水平以及蛋白活性的重要因素。目前有许多商业化的表达载体可用于重组蛋白的表达、生产及后续研究,然而,缺乏具有自主知识产权的高效、稳定、低成本、易纯化的重组蛋白表达系统是目前基因工程药物/疫苗研发、生产和相关生物技术的瓶颈之一。肠出血性大肠杆菌O157:H7分泌蛋白A(Escherichia coli secret protein A,, EspA)为Ⅲ型分泌系统的重要元件,不仅在细菌黏附过程中发挥关键性的启动作用,也在形成A/E损伤的效应分子传递中起到桥梁作用。EspA是一种外膜蛋白,具有良好的免疫原性和免疫反应性,研究表明EspA可作为疫苗研究的候选抗原。我们在进行EHEC O157:H7亚单位疫苗研究的过程中发现EspA在大肠杆菌工程菌中易于高效表达,表达量可达到40%。此外,还发现Stx2A1亚单位在很多原核表达载体中[pET-22b(+),pQE-30,pET-28a(+)]都不表达,而与EspA融合后以融合蛋白的形式获得表达。因此,我们推测EspA是否具有促使原核表达系统高效表达外源目的蛋白的功能,使本身不表达或表达量低的目的蛋白得到高效表达。有鉴于此,本研究拟构建基于EspA的高效原核融合表达载体pEspA,并验证此载体的通用性。pEspA的构建不仅方便EHEC O157:H7基因工程多亚单位融和蛋白疫苗的研究,也为构建具有自主知识产权的高效、稳定、低成本、易纯化的重组蛋白表达系统奠定基础。方法1.高效原核融合表达载体pEspA的设计及构建PCR扩增EHEC O157:H7 espA基因,同时在其C端设计一Linker,包括柔韧区、肠激酶切割位点和多克隆位点。利用重叠延伸的方法将espA和Linker基因融合,通过基因重组技术连接至pET-28a(+)载体构建基于EspA的融合表达载体pEspA。1mmol/L IPTG,37℃条件下诱导EspA蛋白表达。12%SDS-PAGE测定是否有目的蛋白表达。并以EspA单克隆抗体作为一抗,HRP标记的山羊抗小鼠IgG为二抗,进行蛋白的免疫印迹检测。2. pEspA载体通用性研究2.1选择Stx2A1(肠出血性大肠杆菌O157:H7 Stx2毒素A1亚单位)、IL-24、Stx2B(肠出血性大肠杆菌O157:H7 Stx2毒素B亚单位)、GFP(绿色荧光蛋白)、S1(百日咳毒素S1亚单位)、intiminC300(肠出血性大肠杆菌O157:H7紧密黏附素C-端免疫保护性片段)6种外源蛋白作为pEspA载体功能验证的目的蛋白。通过基因工程常规方法将6种外源基因克隆入pEspA载体后,以不同浓度的IPTG(0.1、0.2、0.5、1mM)在不同温度条件下(37℃、25℃、16℃)诱导融合蛋白的表达,12%SDS-PAGE鉴定融合蛋白的表达量,选择最佳诱导条件。以EspA单克隆抗体作为一抗,HRP标记的山羊抗小鼠IgG为二抗,进行融合蛋白的免疫印迹检测。诱导后的重组工程菌超声破菌后分别取上清和沉淀进行12%SDS-PAGE,鉴定目的蛋白的表达形式。2.2利用肠激酶切去融合蛋白中的EspA融合蛋白EspA-IL-24和EspA-GFP经亲和层析纯化后,将pH值调整为7.0-8.0进行肠激酶酶切实验,酶切后样品离心取上清进行SDS-PAGE检测。3.融合蛋白EspA- Stx2A1生物学活性鉴定3.1融合蛋白EspA- Stx2A1的复性和纯化经亲和层析柱对融合蛋白进行纯化后,利用瞬间稀释法对融合蛋白进行复性。取纯化后的融合蛋白进行12%SDS-PAGE分析目的蛋白的纯化效果。Western blot检测融合蛋白与EspA单抗和Stx2A1单抗的免疫反应性。3.2融合蛋白的免疫原性检测选用4-5周龄的Balb/c小鼠,将纯化的融合蛋白与弗氏完全佐剂混合研磨成油包水样,免疫小鼠,抗原量与佐剂量均为100ug/只。采用如下免疫程序:免疫时间为0、1、2周,共3次,每次在小鼠腹部及腹股沟皮下注射总体积0.2ml的相应抗原和佐剂,以PBS为阴性对照。常规ELISA方法检测小鼠血清中特异性针对EspA和Stx2A1抗体的滴度。3.3免疫小鼠的攻毒保护实验选用4-5周龄Balb/c小鼠,随机分为EspA-Stx2A1免疫组、EspA免疫组和PBS对照组。抗原量与佐剂量均为100ug/只,免疫时间为0、1、2周,共3次。各组均于末次免疫14d后以Stx2毒素绝对致死剂量(LD100),总蛋白50ug/ml注入小鼠腹腔进行攻毒。两周观察期结束时计算实验小鼠的死亡数与存活率。3.4融合蛋白免疫小鼠血清的中和作用将Stx2毒素稀释到能够杀死70% HeLa细胞后先与EspA-stx2A1融合蛋白抗血清(或EspA抗血清)于37℃、5%CO2共同孵育1h,再将此混合物加入到HeLa细胞中37℃、5%CO2继续孵育3天,利用MTT法检测小鼠血清的中和活性。3.5 FAS(Fluorescent actin staining)通过FAS试验检测融合蛋白抗血清阻止O157:H7菌与HeLa细胞间粘附和擦拭性(attaching and effacing, A/E)损伤的效果。结果1.重组质粒pEspA经酶切鉴定及测序证实构建成功,pEspA/BL21(DE3)经IPTG诱导后,12%SDS-PAGE检测,可见在25kDa附近出现一条新的蛋白表达条带。免疫印迹结果显示pEspA在工程菌中能表达EspA,说明Linker的插入没有影响EspA的表达。2. 6种外源基因克隆至载体pEspA,构建含有相应融合基因的重组工程菌,实验证明融合蛋白的最佳诱导条件为1mmol/L的IPTG在25℃条件下诱导8小时。以EspA单克隆抗体进行免疫印迹,结果显示高效表达了EspA与六种外源基因的融合蛋白。改变诱导剂浓度对6种融合蛋白的表达形式均未产生影响。降低诱导温度对EspA-GFP、EspA-Stx2B、EspA-intiminC300三种融合蛋白的可溶性表达具有一定的促进作用,而降低诱导温度未促进融合蛋白EspA-S1、EspA-IL-24、EspA-Stx2A1的可溶性表达。融合蛋白EspA-GFP、EspA-IL-24经肠激酶酶切后,经SDS-PAGE均可检测到目的蛋白条带,提示酶切成功;大部分GFP、IL-24仍以可溶形式存在于酶切蛋白液中,这一结果说明EspA的去除并未导致GFP、IL-24产生沉淀。3. EspA-Stx2A1包涵体经洗涤、溶解后利用亲和层析柱进行纯化,纯度可达90%,1 L重组工程菌菌液中可获得120mg的融合蛋白。融合蛋白复性后,1 L重组工程菌菌液中可获得30mg的融合蛋白。Western blot结果显示,重组融合蛋白EspA-Stx2A1与EspA和Stx2A1单克隆抗体均具有免疫反应性。ELISA结果显示融合蛋白具有良好的免疫原性,可刺激小鼠产生分别针对EspA和Stx2A1的特异性抗体。融合蛋白免疫小鼠能够抵御致死剂量Stx2毒素攻击,免疫Balb/c小鼠后血清特异性抗体可以中和Stx2毒素,抗血清浓度为0.04ug/ml时,抑制率达到50%-60%。FAS结果表明融合蛋白抗血清不能阻断O157:H7菌对HeLa细胞的黏附,但能够阻断HeLa细胞肌蛋白的聚集,这说明融合蛋白抗血清在抑制A/E损伤过程中起到重要作用。结论1.成功构建了基于EspA的高效原核融合表达载体pEspA,此载体具有以下特征:①含有T7启动子、卡那霉素抗性基因以及6个连续组氨酸纯化标签(6×His tag)。②espA的羧基端设计了一段Linker,包括柔韧区、肠激酶酶切位点和多克隆位点。柔韧区为EspA和外源蛋白提供了过渡,减少二者在空间结构上的相互干扰及可能出现的一些刚性结构;肠激酶切割位点的设计方便将EspA从融合蛋白中切除;6个多克隆位点均为基因工程常用酶切位点,为外源基因的插入提供方便。2.利用6种外源基因对载体通用性进行了验证,结果表明EspA可促进原核表达系统高效表达外源目的蛋白,使本身不表达或表达量低的目的蛋白得到高效表达,也可使表达的蛋白进一步提高表达量,此外,EspA对一些外源蛋白的可溶性表达具有一定的促进作用。融合蛋白EspA-GFP纯化后在紫外光下呈现绿色荧光,表明GFP与EspA融合后仍保持原有的生物学活性;肠激酶酶切实验结果提示EspA从融合蛋白EspA-GFP、EspA-IL-24中去除并未使目的蛋白产生沉淀。3.利用此系统表达的融合蛋白EspA-Stx2A1经纯化、复性后,我们对其生物学活性进行了研究,结果表明融合蛋白具有免疫原性和免疫反应性,在体内和体外均具有良好的免疫保护效果,因此该融合蛋白可作为O157:H7疫苗的候选抗原。4.此载体的构建不仅方便EHEC O157:H7基因工程多亚单位融和蛋白疫苗的研究,也为构建具有自主知识产权的高效、稳定、低成本、易纯化的重组蛋白表达系统奠定基础。