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研究目的ATP敏感型钾通道(ATP-sensitive potassium channels, KATP)是一种偶联细胞电活动和细胞代谢的特殊通道,在多种不同的组织广泛分布,KATP是由两种不同的亚基(Kir6.x和SURx)以1：1组合形成的异构八聚体,Kir6.x和SUR亚基之间的不同组合可以形成多种不同生理及药理学特征的通道。目前Kir6.2在阿尔茨海默病发生发展中的具体作用机制尚不是很清楚。本研究旨在通过克隆Kir6.2基因,成功构建真核表达载体pcDNA3.0/Kir6.2,并将重组质粒转染HEK293细胞,获得高表达Kir6.2基因的细胞克隆。研究方法1.从SD大鼠脑组织中提取总RNA,采用RT-PCR方法获得Kir6.2基因的全长cDNA,经0.8%琼脂糖凝胶电泳进行初步鉴定,对目的PCR产物进行切胶回收。2.将回收的PCR产物插入pEASY-T1克隆载体,取阳性克隆进行序列测定。3.测序正确的质粒pEASY-T1/Kir6.2用限制内切酶HindⅢ和BamH I进行双酶切,纯化回收约1.2Kb大小的目的片段,质粒pcDNA3.0也进行HindⅢ和BamH I双酶切,纯化回收大片段,用T4 DNA连接酶连接目的片段和线性化的空质粒pcDNA3.0,连接产物转化DH5α感受态细菌进行克隆,菌落PCR扩增Kir6.2基因鉴定阳性细菌克隆。并将PCR产物及抽提的质粒进行电泳分析。4.利用脂质体将重组质粒pcDNA3.0/kir6.2转染HEK293细胞,转染空质粒pcDNA3.0和未经转染的细胞克隆作为对照,转染的细胞经G418筛选获得具有G418抗性的细胞克隆,采用RT-PCR和Western blot方法,鉴定Kir6.2基因在HEK293细胞中的过表达。研究结果1. RT-PCR产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳后得到一条约1.2Kb的特异条带。2. pEASY-T1/Kir6.2测序结果与Gene Bank登录序列(AB043638)进行Blast序列比对,碱基序列完全一致。证明本实验已正确克隆了Kir6.2基因的cDNA序列。3.经PCR和DNA序列测定证实,目的基因Kir6.2已成功插入重组质粒pcDNA3.0/Kir6.2。4.将具有G418抗性的转染pcDNA3.0/Kir6.2的HEK293细胞克隆抽提总RNA,进行RT-PCR反应,得到一约1.2kb的目的条带,而对照组细胞克隆经RT-PCR后无特异性条带生成；具有G418抗性的转染pcDNA3.0/Kir6.2的HEK293细胞克隆经Western Blot证实在40kD处有高表达的Kir6.2蛋白条带,对照组仅有极低水平的内源性kir6.2蛋白表达。均表明转染pcDNA3.0/Kir6.2的HEK293细胞克隆中存在Kir6.2基因。研究结论本研究成功构建了Kir6.2基因的真核表达载体pcDNA3.0/kir6.2,并获得了稳定表达Kir6.2基因的HEK293细胞克隆。研究意义高表达Kir6.2基因的细胞克隆的成功构建为进一步研究Kir6.2基因的生物学功能以及Kir6.2在阿尔茨海默病发病机制中的作用奠定了良好的基础。