筛选木质素降解功能菌株、明确功能菌株木质素降解关键基因及酶，是开发高效微生物降解木质素技术的必要前提。本课题组前期从肉牛新鲜粪样中分离得到一株能够降解木质素的解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）MN13。参考模式菌株解淀粉芽孢杆菌（B.amyloliquefaciens）DSM7的基因序列(FN597644.1)设计引物，对菌株MN13中编码漆酶CotA(Spore coat protein)、染料脱色过氧化物酶(Dye-decolorizing peroxidases，BaDyP)和环裂解双加氧酶(Ring-cleaving dioxygenase)的基因进行克隆，并在Escherichia coli Transetta(DE3)中异源表达。通过液质联用技术(LC-MS)或气质联用技术(GC-MS)分析CotA和BaDyP对木质素模型化合物愈创木基甘油-β-愈创木基醚(Guaiacyl glycerol-β-guaiacol ether，GGE)的降解产物，以期能推断出两者降解GGE的作用途径。同时还通过紫外可见分光光度计全波长扫描技术分析了二者对偶氮类染料（刚果红、铬黑T）和三芳甲烷类染料（结晶紫、溴甲酚绿）的降解作用。研究旨在为解淀粉芽孢杆菌（B.amyloliquefaciens）降解转化木质素为高附加值的芳香族化合物及治理染料污染源奠定理论基础。研究结果如下:
　　解淀粉芽孢杆菌（B.amyloliquefaciens）MN13菌株中cotA基因的完整开放阅读框为1533bp(NCBI在线数据库登录号为MH552410)，编码510个氨基酸。克隆序列经NCBI在线数据库Blast比对，与Bacillus sp.LS02的cotA基因(GU972587.1)的同源性为99％。经E coli Transetta(DE3)表达后的CotA蛋白分子量约为65kDa。CotA在pH4.0～8.0、温度为30～50℃范围内均有酶活力，最适pH为5.6，最适温度为30℃。当温度为50℃时，CotA剩余酶活为50％，温度升至60～80℃时，CotA几乎无酶活力。以木质素二聚体GGE为底物研究发现，CotA能通过断裂GGE的β-O-4键，Cβ-Cγ键并发生Ca氧化和断裂将其降解。此外，CotA在ABTS作用下可将玉米秸秆中的木质素降解为对羟基苯甲醛、4-羟基-3-甲氧基苯乙酮和3-（4-羟基苯基）-丙烯酸。CotA对不同类型的染料均有不同程度的降解作用。经过72h的脱色反应，CotA对结晶紫、溴甲酚绿、刚果红和铬黑T的脱色率分别为57.89％、50.31％、37.62％和50.89％。通过LC-MS对结晶紫的降解产物分析，推断CotA可通过苄位羟基化，氧化以及N-去甲基化等反应，将结晶紫降解成米氏酮和N-去甲基米氏酮等小分子芳香族类化合物。
　　MN13菌株中编码BaDyP的efeb基因的完整开放阅读框为1257bp(NCBI在线数据库登录号为MH886503)，编码418个氨基酸。克隆序列经NCBI在线数据库Blast比对，与B.amyloliquefaciens LM2303(CP018152.1)的同源性为99％，经E coli Transetta(DE3)表达后的BaDyP蛋白分子量大小约为50kDa。在以ABTS为底物测定BaDyP酶活力时发现，在pH3.0～5.0、温度为30～60℃范围内均有酶活力，其最适pH为4.0，最适温度为30℃。BaDyP在H2O2驱动下，能够氧化黎芦醇、ABTS和MnSO4，而对于愈创木酚则无氧化活性。通过分析BaDyP对GGE的降解产物发现，BaDyP可断裂GGE的β-O-4键、Ca-Cβ键，并能进一步氧化Cα，最终生成香草醛。在染料脱色方面，经过72h的脱色反应，BaDyP对刚果红、溴甲酚绿、铬黑T和结晶紫的脱色率分别为65.3％、70.96％、80.06％和63.01％。
　　MN13菌株中编码环裂解双加氧酶(Ring-cleaving dioxygenase)基因的完整开放阅读框为924bp（登录号为MH886504），编码307个氨基酸，克隆序列经NCBI在线数据库Blast比对，与解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)ALB79(CP029071.1)的同源相似性为99.24％。经Ecoli Transetta(DE3)表达后的蛋白分子量约为40kDa。经检测，该酶具有邻苯二酚1，2-双加氧酶活力，对于邻苯二酚型木质素单体具有开环作用，酶活力大小为7.69U/mL。当以邻苯二酚为底物时，环裂解双加氧酶分别在温度30～80℃和pH3.0～8.0范围内均有酶活力，最适温度为70℃，最适pH为4.0。