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普鲁兰酶属于淀粉脱支酶的一种,能够专一性的水解α-1,6-糖苷键。来源于长野芽孢杆菌(Bacillus naganoensis)ATCC53909的普鲁兰酶的最适反应温度为60℃,最适反应pH为4.5,且经过改造热稳定性得到提高,适用于淀粉的糖化加工生产。但是,该酶的表达量和催化效率均较低,与工业生产要求有一定差距,限制了其应用。因此,本文中对普鲁兰酶在地衣芽孢杆菌中的高效表达进行研究,同时对其进行分子改造以提高其催化效率,为其后续工业化应用奠定基础。
地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)是一种生物安全性菌株,本文中选用地衣芽孢杆菌BL10作为表达宿主,为了提高普鲁兰酶表达量,对来自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168菌株和地衣芽孢杆菌BL10菌株中的15种不同信号肽、4种不同启动子进行筛选,构建了不同的重组工程菌株,最终发现在以P43为启动子、apr为信号肽的条件下,菌株的普鲁兰酶表达量最高,在摇床培养24h时培养基上清液中酶活可达12U/mL。
为了提高普鲁兰酶的催化效率,我们采用理性设计的方法对其进行分子改造。首先,对该酶分子进行分析和突变位点选择,最终选出10个位点进行定点突变,共构建单点突变体62个。对突变体进行筛选,发现有5个比活力提高的正突变体,分别为T477C、T477L、Y627F、D679A和D679P,相对于野生型普鲁兰酶而言,比活力分别提高了56.53%、20.65%、16.71%、17.87%和31.62%。在此基础上进行组合突变,构建了两个双点突变体T477C/D679A、T477C/D679P和一个三点突变体T477C/Y627F/D679P,其比活力分别提高了62.68%、65.10%和70.95%。对酶学性质分析结果显示所有突变体的最适反应温度均为60℃,相对于野生型未发生改变;但突变体Y627F和T477C/D679A的最适pH发生了变化,由4.5变为了5.0,其余突变体不变。此外,所有突变体的‰a/Km值相对于野生型都有提高,其中双点突变体T477C/D679P的效果最好,提高了85.76%,同时热稳定性测定实验结果表明除了突变体Y627之外,其余突变体的热稳定性也有不同程度的提高。
本文中通过对启动子及信号肽进行筛选提高了普鲁兰酶在地衣芽孢杆菌中的表达量,提供了一种提高重组工程菌株中目的蛋白表达量的有效手段。此外,通过理性设计对普鲁兰酶进行改造,获得了几个催化效率和热稳定性提高的突变体,为工业化应用奠定了基础。
地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)是一种生物安全性菌株,本文中选用地衣芽孢杆菌BL10作为表达宿主,为了提高普鲁兰酶表达量,对来自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168菌株和地衣芽孢杆菌BL10菌株中的15种不同信号肽、4种不同启动子进行筛选,构建了不同的重组工程菌株,最终发现在以P43为启动子、apr为信号肽的条件下,菌株的普鲁兰酶表达量最高,在摇床培养24h时培养基上清液中酶活可达12U/mL。
为了提高普鲁兰酶的催化效率,我们采用理性设计的方法对其进行分子改造。首先,对该酶分子进行分析和突变位点选择,最终选出10个位点进行定点突变,共构建单点突变体62个。对突变体进行筛选,发现有5个比活力提高的正突变体,分别为T477C、T477L、Y627F、D679A和D679P,相对于野生型普鲁兰酶而言,比活力分别提高了56.53%、20.65%、16.71%、17.87%和31.62%。在此基础上进行组合突变,构建了两个双点突变体T477C/D679A、T477C/D679P和一个三点突变体T477C/Y627F/D679P,其比活力分别提高了62.68%、65.10%和70.95%。对酶学性质分析结果显示所有突变体的最适反应温度均为60℃,相对于野生型未发生改变;但突变体Y627F和T477C/D679A的最适pH发生了变化,由4.5变为了5.0,其余突变体不变。此外,所有突变体的‰a/Km值相对于野生型都有提高,其中双点突变体T477C/D679P的效果最好,提高了85.76%,同时热稳定性测定实验结果表明除了突变体Y627之外,其余突变体的热稳定性也有不同程度的提高。
本文中通过对启动子及信号肽进行筛选提高了普鲁兰酶在地衣芽孢杆菌中的表达量,提供了一种提高重组工程菌株中目的蛋白表达量的有效手段。此外,通过理性设计对普鲁兰酶进行改造,获得了几个催化效率和热稳定性提高的突变体,为工业化应用奠定了基础。