雄甾-4-烯-3,17-二酮(AD)是重要的甾体药物中间体,3-甾酮-△1-脱氢酶(KsdD)能够在微生物转化植物甾醇进行AD生产过程中降解AD,是影响AD积累的关键酶。前期对于KsdD酶结构与活性位点研究主要集中于Rhodococcus来源的KsdD酶,对于催化植物甾醇获得AD的工业生产菌株——分枝杆菌KsdD酶的结构信息相对缺乏。本文采用外源表达、蛋白纯化与结晶、X-ray衍射技术与同源建模、分子对接结合定点突变技术对Mycobacterium neoaurum TCCC 11028(MNR)来源的KsdD酶的结构和活性氨基酸位点进行研究,并对各位点活性机理进行解析。为分枝杆菌KsdD酶的结构和催化机理研究提供了基础数据和理论依据。成功构建了 coli BL21(DE3)-pET-22b(+)-KsdD-MNR,E.coli BL21(DE3)-pET-15b-KsdD-MNR,E.coli BL21(DE3)-pET-28a-KsdD-MNR外源表达菌株,SDS-PAGE全菌蛋白电泳表明KsdD-MNR得以成功表达;经亲和层析、分子筛层析纯化后,灰度分析表明KsdD蛋白纯度约为70%:利用坐滴法对纯化后KsdD蛋白进行蛋白结晶实验,晶体显微镜下观察结合紫外曝光表明1.6mol/L的柠檬酸钠条件下有KsdD蛋白晶体生成;X-ray衍射对KsdD蛋白晶体进行数据收集,衍射结果表明晶体质量较低,无法完成衍射数据收集。利用 MODeller 9.15(http://salilab.org/modeller/)对 MNR来源的 KsdD 结构进行同源建模,利用Syby12.0构建AD小分子结构,并进行底物AD和KsdD酶的分子对接。对接结果表明底物正确对接近KsdD活性口袋,并确定突变位点:Y122F、Y125F、S138A、E140V、Y365F、Y472F、Y541;利用搭桥PCR法进行KsdD基因各位点突变株构建,构建完成后E coli BL21(DE3)-pET-22b(+)-KsdD-MNR和点突变菌株底物转化实验结果显示Y125F、Y365F、Y541F突变株转化率几乎为零,Y122F、S138A、E140V突变株转化率有不同程度下降,Y472F突变株转化率与野生型相比无明显差异。表明各突变位点对KsdD酶C1.2位的脱氢能力产生不同影响。利用Swiss-model(http://swissmodel.expasy.org/)对突变各位点进行模拟点突变,基于突变位点局部结构对各位点活性机理进行了解析。Tyr-365在Tyr-125的辅助下进行底物A环C2位上的氢的移除,同时,此过程能被Y122F突变所影响;Tyr-541和Gly-545共同负责底物A环C3羰基在消除反应中间态的稳定;Ser-138能够与Val-57、Val-139、Pro-544分别形成氢键,这些氢键对底物所在loop区域稳定十分重要;Glu-140侧链可能和底物AD一起占据了 KsdD酶的活性口袋底物入口部位,从而阻止溶剂进入,这对于KsdD酶所催化反应的疏水环境的维持十分重要。