松材线虫病(pinewilt disease)是松属的一种毁灭性病害,具有发病致死速度快、传播蔓延迅速、防治难度大等特点,是严重威胁全世界林业生产的重大检疫性病害之一。该病由松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)引起,目前国内外尚无很好的根除方法,唯有通过设立和建设无病区、加强植物检疫严防病害传入。因此,加强病害的早期诊断和检测技术的研究尤为重要。松材线虫的传统检测技术(如形态鉴定、生理生化鉴定方法等)或多或少存在一定的局限性,如特异性差、灵敏度低等,尤为关键的是不能对病害进行早期快速准确检测。而核酸水平的分子检测技术,特别是聚合酶链式反应(PCR)作为检测技术具有快速、特异、灵敏的特点,可以满足国内外现代植物检疫的要求。研究目的:本文对松材线虫核酸分子检测技术进行了系统的研究,旨在建立起快速准确稳定安全的松材线虫分子检测技术体系,实现松材线虫样品的快速检验,为松树非疫区生产建设和病害预警监测提供一种分子检测技术和实用工具。研究内容和方法:比较改进CTAB法、试剂盒法和浸泡过滤法提取松材线虫和拟松材线虫( B.mucroratus )DNA的适用性;利用引物设计软件Primer Premier 5.0进行引物的设计;PCR同步扩增拟松材线虫、小杆线虫(Caenorhabd itis spp)、伪伞滑刃线虫(B. fraudulentus)和其他腐生线虫(saprophytic nematodes)等多种线虫来验证检测的特异性;PCR扩增松材线虫基因组DNA以测定检测的灵敏度;通过在不同DNA扩增仪和温度控制方式下的扩增程序测定检测的稳定性;将DNA靶片段与克隆载体pMD-18T连接后,用CaCl2法转化大肠杆菌(Escherichia. coli,JM109),然后通过测序来验证PCR扩增产物的准确性;以重组质粒和转化的大肠杆菌构建了无害化阳性参照体系;采用预混PCR反应液中加入生物活性分子稳定剂(MS)并冷冻干燥固相化处理的方法研制出能常温贮存的方便有效的检测试剂盒。利用优化的分子检测体系对天津、广西、湖南、重庆和四川等地采集的松木样品进行了PCR实际检测;利用BIO-RAD iCycler iQ定量PCR仪对松材线虫的定量检测做了初步的研究。研究结果:①通过比较研究不同制样方法对检测效果的影响,确定浸泡过滤法能有效地排除植物色素、蛋白质、多糖等物质对PCR反应的干扰,可以从木屑中直接提取适合于PCR反应的松材线虫DNA模板,检测限度到达了1条线虫/ 1.5g木屑,建立了从木屑中快速提取线虫DNA的制样方法。②根据松材线虫特异的基因序列设计不同的引物对,通过比较筛选出特异性强、稳定性好、灵敏度高(灵敏度达到200 pg/25μL)的引物对cqubs01/cquba01,并由此建立了准确、快速、灵敏、稳定、安全的松材线虫PCR检测体系。③根据拟松材线虫特异的基因序列设计不同的引物对,通过比较筛选出特异性强稳定性好灵敏度高的引物对cqubms01/cqubma01,并与松材线虫引物cqubs01/cquba01组合,由此建立了准确、快速、灵敏、稳定、安全的松材线虫和拟松材线虫双重PCR检测体系。④cqubs01/cquba01用于SYBR Green I实时荧光定量PCR检测,灵敏度达到100 fg/25μL,与常规PCR相比更灵敏、更简便、更快速,且保持了较低的检测成本。⑤利用浸泡过滤方法提取的线虫总DNA由于含量不同而且保存期限短,不宜作为阳性对照。而以转化的病菌靶序列重组质粒DNA和重组子作为阳性对照,不仅检测稳定、效果理想,而且安全可靠,可以用作定量检测的标准样品。⑥预混PCR反应液中加入适量的生物活性分子稳定剂,对DNA聚合酶,dNTPs等生物大分子具有良好的常温稳定作用,含有MS的预混PCR反应试剂经冷真空冻干燥处理后可以于常温下保存至少半年以上。结论:本研究利用改良的DNA提取方法及构建的重组阳性对照,成功的建立了快速、稳定、可靠的松材线虫定性及定量分子检测体系。从样品的制备到获得最终的检测结果,该体系仅用时6h,符合实际检测的要求。因此该技术可以广泛地用于出入境木材检疫检验、松树非疫生产区松材线虫病疑似样品鉴定和病害早期诊断监测。