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重金属污染土壤的修复是人们普遍关注的热点问题,微生物与植物在重金属污染土壤修复和生态重建中发挥着重要作用。深色有隔内生真菌(Dark Septate Endophytes,DSE)是一类现种类组成和生态学功能都不甚明确的在胁迫环境中常见的定殖于植物根部的小型内生真菌,研究表明DSE可能具有多种生态学功能,如可以为宿主植物提供各种无机元素和帮助植物利用有机营养物;在帮助宿主植物抵抗病虫害、高盐、干旱及重金属污染等逆境方面中都起着重要作用。本实验室前期的一些研究发现重金属矿区自然生长植物的根系普遍被DSE定殖并显现出较高的定殖率,分离自重金属污染区的DSE大多数都对不同重金属具有较高的耐受性和积累能力。尤其是一株分离自会泽铅锌矿区的DSE嗜鱼外瓶霉(Exophialapisciphila)H93菌株,对Pb、Zn、Cd等重金属都显示出了极强的耐受性和富集能力。但是,目前对DSE吸收、积累重金属的机制却不了解。天然抵抗力相关巨噬细胞蛋白家族(Natural Resistance Associated Macrophage Proteins,NRAMP)是从哺乳动物到细菌体内普遍存在的参与金属离子转运过程的一个重要的转运蛋白,已有的研究表明NRAMP基因家族可能与二价金属阳离子的转运有密切的联系,有关植物和哺乳动物的NRAMPs研究报道已经很多,但是真菌中只有少数几个物种的NRAMP基因得到克隆并验证了功能,DSE中有关此基因克隆和功能的研究还尚未见报道。因此研究DSE中二价金属阳离子转运蛋白NRAMP基因的功能有助于揭示DSE抗重金属的分子机理,从而为从基因水平上探讨DSE促进重金属矿区植物修复的分子机理、DSE的生态学功能、以及为云南重金属矿区及受污染土地的生物修复提供理论基础。本研究以深色有隔内生真菌(DSE)H93菌株为试材,克隆得到了NRAMP基因的DNA全长序列和cDNA编码区全长序列,并对其功能进行了初步研究,取得了如下研究成果:
1.NRAMP基因的克隆
采用同源克隆的方法从H93菌株总DNA中获取了NRAMP基因的一段保守区序列(约550 bp),进一步采用染色体步移法(Genome Walking)和RT-PCR技术克隆得到了NRAMP基因的DNA全长序列和cDNA开放阅读框(ORF)全长序列。序列分析结果表明,NRAMP基因DNA全长4225 bp,其编码区(ORF区)中含有1个长度为65 bp的内含子。NRAMP基因cDNA编码区全长1716 bp,共编码371个氨基酸,分子量(Mw)约为62.1 kDa,等电点(pI)约为6.46,将其命名为EpNramp。利用生物信息学的手段对此蛋白的理化性质和二级结构进行了初步的预测分析,结果表明构成此蛋白的氨基酸大多数都为疏水性氨基酸,这为氨基酸的跨膜折叠提供了潜在的动力;进一步的预测发现此蛋白具有11个跨膜结构域,蛋白序列的N-末端定位于细胞内且不含信号肽序列;同源性和系统发育分析表明,不同真菌来源的NRAMP具有较高的同源性,不同生物来源的NRAMP根据其来源形成了不同的进化分枝。
2.NRAMP基因的功能验证
采用酵母异源功能互补法对克隆得到的NRAMP基因cDNA-ORF区进行了功能的初步研究。利用pFL61载体将得到的cDNA-ORF基因转入酿酒酵母铁转运功能缺失突变株DEY1453,结果使得它在缺铁培养基平板上无法生长的性状得到了恢复,说明NRAMP可以部分或完全的在酿酒酵母中发挥转运铁的功能。