背景及目的胃癌是指来源于胃粘膜上皮和腺上皮的恶性肿瘤,在胃的恶性肿瘤中胃癌约占95%。胃癌是人类常见的恶性肿瘤,在所有恶性肿瘤的发病率中占第二位,是严重危害人类生命健康的恶性疾病之一。同其他肿瘤一样,胃癌的发生是一个多因素、多步骤的复杂过程,是多种改变在细胞内累积,从量变到质变的过程。Correa总结了胃癌流行病病因学的研究结果,提出人肠型胃癌的发生模式:正常胃粘膜-慢性浅表性胃炎-慢性萎缩性胃炎-肠上皮化生-异型增生-早期癌-进展期癌。胃粘膜肠上皮化生(又称肠化生)是指胃粘膜上皮及腺上皮在病理情况下转变为肠粘膜上皮及腺上皮。胃粘膜肠上皮化生是胃癌发生过程中重要的步骤。胃粘膜肠上皮化生向胃癌进展的过程与多种基因有关。尾型同源异形盒基因CDX2(caudal type homeobox gene 2)属于同源盒基因(homeobox genes,Hox genes)家族中一员,最早是由Mlodzik于果蝇中分离成功,它是肠道特异性转录因子,在胚胎发育中其表达产物广泛存在于胚胎消化道腺上皮中,对于后部体节和消化道的形成、发育和成熟起重要作用,在出生后,正常情况下在胃粘膜上皮中不表达,广泛表达于小肠及结肠粘膜,对肠上皮的分化以及形态和功能的维持也具有决定性的意义。有研究显示CDX2在慢性萎缩性胃炎相关的肠上皮化生中高表达并在部分胃癌中表达,表明其有可能与胃粘膜向肠上皮转化及胃粘膜癌变发生有关。现代分子生物学认为,遗传学和表观遗传学共同调控生物信息的表达,遗传信息提供了“生产”所必需蛋白质的“蓝本”,而表观遗传学则指示细胞怎样、何时和何地表达这些信息。表观遗传学是指在不影响基因序列的情况下由DNA的甲基化/去甲基化及组蛋白的乙酰化/去乙酰化不同状态引起基因的表达改变。DNA甲基化指由DNA甲基转移酶(DNA methyltransferases,DNMTs)介导,在CpG二核苷酸胞嘧啶5位碳原子上加入一甲基基团,使之变成5-甲基胞嘧啶(5-mC)的化学反应,生物学功能主要表现为在序列不变的情况下,控制基因表达,维护染色体的完整性和调节重组及某些特定基因组区域的转录活性。与突变等遗传学基因异常不同的是,抑癌基因的高甲基化状态是可逆的,应用甲基转移酶抑制剂将处于甲基化状态的基因进行去甲基化激活,可以恢复某些关键性抑癌基因的功能而起到预防和治疗肿瘤的作用,为我们进一步研究去甲基化试剂抗肿瘤提供了很好的依据,所以抑癌基因的甲基化研究不仅对恶性肿瘤的病因、早期诊断及预后评价有很大价值,而且对肿瘤的基因治疗研究有着不可替代的作用。目前,有关CDX2在胃癌、大肠癌、食管癌等肿瘤中的异常甲基化也有报道,并推测其与肿瘤的治疗、预后有关。但目前对胃粘膜肠上皮化生中的CDX2基因CpG岛甲基化状态的研究较少。本研究通过检测CDX2基因在不同亚型肠上皮化生和胃癌中的表达和甲基化状态,及其与临床特点的关系,初步探讨了CDX2在肠上皮化生向胃癌转变过程中的作用及机制。内容包括:1.CDX2在肠上皮化生和胃癌中的蛋白表达;2.CDX2在肠上皮化生和胃癌中的启动子甲基化状态;3.5-aza-CdR对人胃癌细胞KATO-Ⅲ和AGS中CDX2 mRNA表达和启动子甲基化状态的影响。材料和方法(一)材料1.2008年3月至2008年7月期间于南方医院消化内镜中心因上腹部不适、早饱、嗳气等症状行胃镜检查并病理诊断肠上皮化生患者53例,其中男37例,女16例,年龄35-74岁,平均57岁。另取18例无主观症状且病理检查排除IM及胃癌的健康检查者胃粘膜。每例均于距幽门口1-2cm处活组织检查。胃癌组织来自于同时期南方医院手术切除组织。所有标本均于离体后20min内获取,一部分制作蜡块,另一部分液氮速冻,然后放置于-80℃保存。所有患者均无己知严重的心脏、肝肾功能不全以及精神病史,胃癌患者手术前未接受化疗或放射治疗。所有患者均知情同意。2.人胃癌细胞株KATO-Ⅲ和AGS,来自于ATCC。(二)方法1.运用高铁二铵-爱先蓝-过碘酸雪夫反应(HID-AB-PAS)将肠上皮化生分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型,按照Lauren’s分型将胃癌分为肠型和弥漫型;2.运用免疫组织化学方法检测组织中CDX2蛋白表达情况;3.采用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)检测组织中CDX2启动子甲基化状态。4.RT-PCR和MSP分别检测5-aza-CdR处理前后两种胃癌细胞中CDX2mRNA表达和启动子甲基化状态。(三)统计学分析实验数据采用SPSS13.0软件包的x~2检验和方差分析等检验方法进行统计学分析。结果(一)基本情况:正常胃粘膜18例,肠上皮化生53例,包括Ⅰ型22例,Ⅱ型18例,Ⅲ型13例。胃癌36例,包括肠型胃癌21例,弥漫型胃癌15例。(二) CDX2的表达情况1.CDX2在正常胃粘膜中不表达。不同亚型肠上皮化生中CDX2表达阳性率(分别为Ⅰ型95.5%,Ⅱ型83.3%,Ⅲ型61.5%)有显著差异(P=0.036),呈逐渐降低趋势。胃癌中CDX2的阳性表达率(52.8%)显著低于肠上皮化生(83.0%)(P=0.002),且与胃癌的组织学类型有关,肠型胃癌中CDX2阳性表达率(71.4%)显著高于弥漫型胃癌(26.7%)(P=0.008)。2.肠上皮化生和胃癌病例中CDX2表达均主要集中于H.pylori感染阴性者,肠上皮化生中两者列联系数C=0.267,P=0.067,胃癌组织中两者列联系数为C=0.121,P=0.463,H.pylori感染对CDX2表达无影响。3.胃癌中CDX2表达与年龄、性别无关;无淋巴结转移组CDX2阳性表达率(100.0%)显著高于淋巴结转移组(43.3%)(列联系数C=0.390,P=0.020),但两者关系不密切;CDX2与浸润深度的列联系数C=0.317,P=0.106,提示肿瘤浸润深度与CDX2表达不相关。(三) CDX2启动子甲基化状态1.正常胃粘膜全部表现出CDX2启动子甲基化,肠上皮化生中CDX2启动子甲基化率为43.4%,(其中Ⅰ型22.7%,Ⅱ型55.6%,Ⅲ型61.5%),显著低于胃癌中CDX2启动子甲基化率(69.4%)(P=0.016),不同亚型肠上皮化生中CDX2启动子甲基化率也有显著性差异(P=0.036)。CDX2启动子甲基化率在肠型胃癌中(66.7%,14/21)低于弥漫型(73.3%,11/15),但两者无统计学差异(P＞0.05)。2.胃癌中无淋巴结转移组CDX2启动子甲基化率(50.0%)低于淋巴结转移组(73.3%)(列联系数C=0.185,P=0.343),但差异无统计学意义;CDX2启动子甲基化状态与浸润深度的列联系数C=0.323,P=0.041,提示肿瘤浸润深度与CDX2启动子甲基化状态有关,且浸润越深,甲基化率越高,两者的关系不密切。3.肠上皮化生中CDX2启动子甲基化病例中CDX2表达阳性率(36.4%)显著低于非甲基化病例(列联系数C=0.299,P=0.031),胃癌中CDX2启动子甲基化病例中CDX2表达阳性率(47.4%)亦显著低于非甲基化病例(94.1%)(列联系数C=0.452,P=0.002),CDX2启动子甲基化可导致CDX2表达减少。(四)未经5-aza-CdR去甲基化处理的胃癌细胞AGS内发现CDX2mRNA的表达,启动子为非甲基化;而KATO-Ⅲ细胞内未发现CDX2 mRNA的表达,启动子为甲基化。经过5-aza-CdR药物行去甲基化处理后KATO-Ⅲ细胞内CDX2 mRNA得到重新表达,启动子则转变为非甲基化。结论(一) CDX2在肠上皮化生向胃癌的转化过程中呈逐渐降低趋势,可能起着抑制癌基因作用;(二) CDX2启动子甲基化是导致CDX2表达缺失的主要机制,表观遗传学机制是胃癌发生的重要分子机制。(三) 5-aza-CdR能通过使CDX2启动子去甲基化而使胃癌细胞KATO-Ⅲ中CDX2 mRNA再次表达,CDX2基因启动子甲基化是使该基因失活的重要原因,去甲基化后该基因得到重新表达。通过药物或其他手段对CDX2基因甲基化状态进行调控达到对胃癌发生的抑制作用,从而有望在胃癌临床治疗上提供新思路。