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研究背景：
脑卒中后中枢痛（Central post-stroke pain, CPSP）是中枢性神经病理性疼痛最常见的类型，它是由各种脑血管疾病引起中枢神经系统损伤导致的躯体感觉异常，其发生率约为8-11%，最常见卒中部位为丘脑。新近的影像学临床研究分析显示，引起丘脑卒中后中枢痛的损伤部位在丘脑后、下、外侧核，且主要集中在丘脑腹后外侧核，疼痛患者主要表现为自发性疼痛、痛觉过敏和痛觉超敏。脑卒中后中枢痛发病机制复杂，对目前临床一线药物反应较差，且持续时间长，严重影响脑卒中后康复期内的生活质量。因此，阐明丘脑卒中后疼痛发生发展的病理生理机制，寻求切实有效的干预措施来减轻或阻止脑卒中后中枢痛的发生和发展，已成为临床上亟待解决的问题。
环氧二十碳三烯酸(epoxyeicosatrienoic acids, EETs)是花生四烯酸代谢产生的主要活性物质之一，包括4种异构体，即5,6-, 8,9-, 11,12-, 14,15-EET，其中14,15-EET在血浆中浓度最高，进一步通过可溶性环氧化水解酶(soluble epoxide hydrolase，sEH)水解，生成低活性的双羟二十碳三烯酸。近年来，研究表明EETs在神经系统可发挥多种作用，如通过增加星形胶质细胞释放血管内皮生长因子减轻缺血缺氧性脑损伤，调节脑血流量改善脑缺血再灌注损伤，14,15-EET 可抑制氧糖剥夺/复氧诱导的 BV2 小胶质细胞炎症反应，14,15-EET可通过C-Jun氨基端激酶和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路，抑制脑微血管平滑肌细胞的凋亡。此外，研究还显示EETs或sEH抑制剂可通过降低环氧化酶-2的表达；同时，升高环磷酸腺苷上调类固醇急性调节蛋白的表达促进神经甾体合成，可能通过激活 A 型γ氨基丁酸受体在炎性疼痛中发挥镇痛作用；也可减轻内质网应激缓解疼痛，如给予sEH抑制剂TPPU可减轻糖尿病周围神经痛；sEH抑制剂还可通过降低坐骨神经痛大鼠模型背根神经节DRG中TNF-α、IL-1β、COX-2的表达，产生抗炎镇痛效应。这些研究表明：1. EETs对脑卒中缺血缺氧性损伤具有众多的神经保护作用；2. EETs及sEH抑制剂在炎性疼痛、痛性糖尿病神经病变等神经病理性疼痛中均能发挥镇痛作用。但EETs及sEH抑制剂在脑卒中后中枢痛中的作用及机制目前尚未明确。
因此，为进一步探讨EETs在脑卒中后中枢痛中的作用及机制，本研究拟构建丘脑卒中后疼痛模型，采用行为学、形态学及分子生物学等技术，探讨14,15-EET在丘脑卒中后疼痛的发展和维持中的作用及其相关机制，为脑卒中后中枢痛的治疗提供进一步的理论参考。
研究方法与结果：
第一部分 丘脑卒中后疼痛模型丘脑14,15-EET及AP-δGABAAR信号通路的改变
方法：
将100只SD(Sprague Dawley)大鼠随机分为两组：假手术组（Sham）和脑卒中后中枢痛（central post-stroke pain, CPSP）组，丘脑腹后外侧核（ventroposterior lateral nucleus, VPL）内立体定位注射Ⅳ型胶原酶构建CPSP模型，于-1天(d)及术后第7， 14，21，28d不同时间点，采用von Frey丝及Hargreave法分别测定大鼠足底的机械性痛阈（paw withdrawal mechanical threshold，PWMT）及热刺激缩足反应潜伏期（paw withdraw thermal latency，PWTL）。同时，采用高效液相色谱串联质谱(High Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry，HPLC-MS)检测大鼠丘脑内14,15-EET的含量变化，酶联免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）检测丘脑四氢孕酮（allopregnanolone, AP）的浓度，免疫荧光及western blot法测定类固醇急性调节蛋白(steroidogenic acute regulatory, StAR)，含δ-亚基的γ-氨基丁酸A受体（δ-subunit-containing gamma-aminobutyric acid A receptors, δGABAAR)的含量变化。
结果：
（1） SD大鼠于术后第7 d表现出PWMT降低，且对侧降低更明显，至少持续至第28 d，而PWTL无明显改变；丘脑VPL内14,15-EET含量于CPSP建模后第7d出现明显降低，持续至术后第 28 天；免疫荧光及 Western-Blot 结果显示 StAR于术后7 d开始明显降低，且术后第14 d降至最低；丘脑VPL中AP的含量于术后7 d开始明显降低，且术后第14 d降至最低；而免疫荧光及Western-Blot结果显示，内侧丘脑δGABAAR表达呈进行性降低。
第二部分 14,15-EET通过增强AP-δGABAAR信号通路缓解大鼠丘脑卒中后疼痛
方法：
（1）CPSP建模后，将出现疼痛的SD大鼠随机分为5组(n = 20/组)：CPSP, vehicle, 0.025, 0.05及0.1μg EET组，于建模后连续3d给予vehicle（1% DMSO）、不同浓度的14,15-EET（0.025,0.05, 0.1μg）、以及14,15-EEZE（3.25ng）+14,15-EET(0.1μg)，于术前1d及术后第7，14，21，28d不同时间点，采用von Frey纤维丝测定大鼠足底的PWMT。于第14 d，采用PCR、免疫荧光及western-blot法检测StAR和δGABAAR蛋白的表达，ELISA法检测AP的浓度变化。
（2）将SD大鼠分为4组(n = 10/组)，分别采用5α还原酶抑制剂（finasteride， FIN和dutasteride, DUT）抑制AP合成（CPSP+vehicle, CPSP+EET, CPSP+EET+FIN, CPSP+EET+DUN组），采用von Frey纤维丝观察术后第7，14，21，28 d不同时间点大鼠足底的PWMT。
（3）将CPSP大鼠分为3组(n = 10/组)，进一步采用GABAAR拮抗剂（bicuculline, BIC）拮抗AP-GABAAR通路（CPSP+vehicle, CPSP+EET, CPSP+EET+BIC），采用von Frey纤维丝观察给药后第0.5, 1, 2, 3, 4 h不同时间点大鼠足底的PWMT。
结果：
（1） 术后早期给予14,15-EET 可升高足底PWMT 阈值，缓解大鼠足底触诱发痛，可持续至术后第28d，且0.1μg 14,15-EET的镇痛作用可达到峰值，而14,15-EEZE可弱化14,15-EET的镇痛作用。免疫荧光及western-blot结果发现14,15-EET可以增加StAR蛋白的表达；升高AP的浓度；上调δGABAAR蛋白的表达。
（2） 14,15-EET可升高CPSP模型鼠PWMT阈值，改善机械性痛觉超敏反应，而FIN及DUT均可抵消14,15-EET的镇痛效应。
（3） GABAAR的拮抗剂BIC可减弱14,15-EET在CPSP大鼠中的镇痛效应。
第三部分 探讨14,15-EET改善大鼠丘脑卒中后疼痛的其它可能机制
方法：
（1） 为了观察CPSP模型中的炎症反应及凋亡相关蛋白的表达情况，将100只SD大鼠随机分为2组：Sham组和CPSP模型组。于术前1 d及术后第7，14，21， 28 d不同时间点，采用von Frey纤维丝测定大鼠足底的PWMT，并采用免疫荧光检测星形胶质细胞和小胶质细胞激活、ELISA 试剂盒测定促炎症因子（IL-1β、IL-6 及TNF-α）和抗炎细胞因子（IL-4及IL-10）的表达及western blot测定凋亡相关蛋白Bax,活化的caspase3及Bcl-2的表达情况。
（2） 为了探讨14,15-EET抑制CPSP的炎症及凋亡情况，将75只SD大鼠随机分为5组：CPSP模型组、0.025、0.05、0.1 μg 14,15-EET组及0.1 μg 14,15-EET +14,15-EEZE组(n =15/组)。于术前1 d及术后第7，14，21，28 d不同时间点，采用von Frey纤维丝测定大鼠足底的PWMT，并于术后第14 d，western blot检测凋亡相关蛋白Bax, 活化的caspase3及Bcl-2的表达情况，于术后第28 d，采用免疫荧光观察星形胶质细胞和小胶质细胞激活情况、ELISA 试剂盒检测促炎症因子（IL-1β、IL-6及TNF-α）和抗炎细胞因子（IL-4及IL-10）的表达及。
结果：
（1） CPSP大鼠丘脑VPL区星形胶质细胞和小胶质细胞激活，促炎症细胞因子表达增加，抗炎细胞因子减少，14,15-EET 可抑制星形胶质细胞和小胶质细胞激活，降低促炎细胞因子水平，增加抗炎细胞因子表达，通过抑制丘脑 VPL 区炎症反应，从而缓解CPSP大鼠机械性痛觉超敏反应；
（2） CPSP 大鼠丘脑 VPL 区凋亡相关蛋白增加，抗凋亡蛋白降低，14,15-EET可减轻丘脑VPL区凋亡，从而缓解CPSP大鼠机械性痛觉超敏反应。
结论：
（1） 右侧丘脑VPL出血性卒中可导致双侧足底机械性痛觉超敏反应，同时VPL中14,15-EET的含量及AP的浓度降低，内侧丘脑δGABAAR表达下调；
（2） 14,15-EET通过上调StAR蛋白的表达，进而促进AP的合成，同时增加内侧丘脑δGABAAR的表达，增强AP-δGABAAR信号通路，缓解CPSP；
（3） 14,15-EET 通过抑制炎症细胞激活，降低促炎细胞因子表达，下调凋亡相关蛋白，从而在CPSP大鼠中发挥镇痛作用。
脑卒中后中枢痛（Central post-stroke pain, CPSP）是中枢性神经病理性疼痛最常见的类型，它是由各种脑血管疾病引起中枢神经系统损伤导致的躯体感觉异常，其发生率约为8-11%，最常见卒中部位为丘脑。新近的影像学临床研究分析显示，引起丘脑卒中后中枢痛的损伤部位在丘脑后、下、外侧核，且主要集中在丘脑腹后外侧核，疼痛患者主要表现为自发性疼痛、痛觉过敏和痛觉超敏。脑卒中后中枢痛发病机制复杂，对目前临床一线药物反应较差，且持续时间长，严重影响脑卒中后康复期内的生活质量。因此，阐明丘脑卒中后疼痛发生发展的病理生理机制，寻求切实有效的干预措施来减轻或阻止脑卒中后中枢痛的发生和发展，已成为临床上亟待解决的问题。
环氧二十碳三烯酸(epoxyeicosatrienoic acids, EETs)是花生四烯酸代谢产生的主要活性物质之一，包括4种异构体，即5,6-, 8,9-, 11,12-, 14,15-EET，其中14,15-EET在血浆中浓度最高，进一步通过可溶性环氧化水解酶(soluble epoxide hydrolase，sEH)水解，生成低活性的双羟二十碳三烯酸。近年来，研究表明EETs在神经系统可发挥多种作用，如通过增加星形胶质细胞释放血管内皮生长因子减轻缺血缺氧性脑损伤，调节脑血流量改善脑缺血再灌注损伤，14,15-EET 可抑制氧糖剥夺/复氧诱导的 BV2 小胶质细胞炎症反应，14,15-EET可通过C-Jun氨基端激酶和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路，抑制脑微血管平滑肌细胞的凋亡。此外，研究还显示EETs或sEH抑制剂可通过降低环氧化酶-2的表达；同时，升高环磷酸腺苷上调类固醇急性调节蛋白的表达促进神经甾体合成，可能通过激活 A 型γ氨基丁酸受体在炎性疼痛中发挥镇痛作用；也可减轻内质网应激缓解疼痛，如给予sEH抑制剂TPPU可减轻糖尿病周围神经痛；sEH抑制剂还可通过降低坐骨神经痛大鼠模型背根神经节DRG中TNF-α、IL-1β、COX-2的表达，产生抗炎镇痛效应。这些研究表明：1. EETs对脑卒中缺血缺氧性损伤具有众多的神经保护作用；2. EETs及sEH抑制剂在炎性疼痛、痛性糖尿病神经病变等神经病理性疼痛中均能发挥镇痛作用。但EETs及sEH抑制剂在脑卒中后中枢痛中的作用及机制目前尚未明确。
因此，为进一步探讨EETs在脑卒中后中枢痛中的作用及机制，本研究拟构建丘脑卒中后疼痛模型，采用行为学、形态学及分子生物学等技术，探讨14,15-EET在丘脑卒中后疼痛的发展和维持中的作用及其相关机制，为脑卒中后中枢痛的治疗提供进一步的理论参考。
研究方法与结果：
第一部分 丘脑卒中后疼痛模型丘脑14,15-EET及AP-δGABAAR信号通路的改变
方法：
将100只SD(Sprague Dawley)大鼠随机分为两组：假手术组（Sham）和脑卒中后中枢痛（central post-stroke pain, CPSP）组，丘脑腹后外侧核（ventroposterior lateral nucleus, VPL）内立体定位注射Ⅳ型胶原酶构建CPSP模型，于-1天(d)及术后第7， 14，21，28d不同时间点，采用von Frey丝及Hargreave法分别测定大鼠足底的机械性痛阈（paw withdrawal mechanical threshold，PWMT）及热刺激缩足反应潜伏期（paw withdraw thermal latency，PWTL）。同时，采用高效液相色谱串联质谱(High Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry，HPLC-MS)检测大鼠丘脑内14,15-EET的含量变化，酶联免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）检测丘脑四氢孕酮（allopregnanolone, AP）的浓度，免疫荧光及western blot法测定类固醇急性调节蛋白(steroidogenic acute regulatory, StAR)，含δ-亚基的γ-氨基丁酸A受体（δ-subunit-containing gamma-aminobutyric acid A receptors, δGABAAR)的含量变化。
结果：
（1） SD大鼠于术后第7 d表现出PWMT降低，且对侧降低更明显，至少持续至第28 d，而PWTL无明显改变；丘脑VPL内14,15-EET含量于CPSP建模后第7d出现明显降低，持续至术后第 28 天；免疫荧光及 Western-Blot 结果显示 StAR于术后7 d开始明显降低，且术后第14 d降至最低；丘脑VPL中AP的含量于术后7 d开始明显降低，且术后第14 d降至最低；而免疫荧光及Western-Blot结果显示，内侧丘脑δGABAAR表达呈进行性降低。
第二部分 14,15-EET通过增强AP-δGABAAR信号通路缓解大鼠丘脑卒中后疼痛
方法：
（1）CPSP建模后，将出现疼痛的SD大鼠随机分为5组(n = 20/组)：CPSP, vehicle, 0.025, 0.05及0.1μg EET组，于建模后连续3d给予vehicle（1% DMSO）、不同浓度的14,15-EET（0.025,0.05, 0.1μg）、以及14,15-EEZE（3.25ng）+14,15-EET(0.1μg)，于术前1d及术后第7，14，21，28d不同时间点，采用von Frey纤维丝测定大鼠足底的PWMT。于第14 d，采用PCR、免疫荧光及western-blot法检测StAR和δGABAAR蛋白的表达，ELISA法检测AP的浓度变化。
（2）将SD大鼠分为4组(n = 10/组)，分别采用5α还原酶抑制剂（finasteride， FIN和dutasteride, DUT）抑制AP合成（CPSP+vehicle, CPSP+EET, CPSP+EET+FIN, CPSP+EET+DUN组），采用von Frey纤维丝观察术后第7，14，21，28 d不同时间点大鼠足底的PWMT。
（3）将CPSP大鼠分为3组(n = 10/组)，进一步采用GABAAR拮抗剂（bicuculline, BIC）拮抗AP-GABAAR通路（CPSP+vehicle, CPSP+EET, CPSP+EET+BIC），采用von Frey纤维丝观察给药后第0.5, 1, 2, 3, 4 h不同时间点大鼠足底的PWMT。
结果：
（1） 术后早期给予14,15-EET 可升高足底PWMT 阈值，缓解大鼠足底触诱发痛，可持续至术后第28d，且0.1μg 14,15-EET的镇痛作用可达到峰值，而14,15-EEZE可弱化14,15-EET的镇痛作用。免疫荧光及western-blot结果发现14,15-EET可以增加StAR蛋白的表达；升高AP的浓度；上调δGABAAR蛋白的表达。
（2） 14,15-EET可升高CPSP模型鼠PWMT阈值，改善机械性痛觉超敏反应，而FIN及DUT均可抵消14,15-EET的镇痛效应。
（3） GABAAR的拮抗剂BIC可减弱14,15-EET在CPSP大鼠中的镇痛效应。
第三部分 探讨14,15-EET改善大鼠丘脑卒中后疼痛的其它可能机制
方法：
（1） 为了观察CPSP模型中的炎症反应及凋亡相关蛋白的表达情况，将100只SD大鼠随机分为2组：Sham组和CPSP模型组。于术前1 d及术后第7，14，21， 28 d不同时间点，采用von Frey纤维丝测定大鼠足底的PWMT，并采用免疫荧光检测星形胶质细胞和小胶质细胞激活、ELISA 试剂盒测定促炎症因子（IL-1β、IL-6 及TNF-α）和抗炎细胞因子（IL-4及IL-10）的表达及western blot测定凋亡相关蛋白Bax,活化的caspase3及Bcl-2的表达情况。
（2） 为了探讨14,15-EET抑制CPSP的炎症及凋亡情况，将75只SD大鼠随机分为5组：CPSP模型组、0.025、0.05、0.1 μg 14,15-EET组及0.1 μg 14,15-EET +14,15-EEZE组(n =15/组)。于术前1 d及术后第7，14，21，28 d不同时间点，采用von Frey纤维丝测定大鼠足底的PWMT，并于术后第14 d，western blot检测凋亡相关蛋白Bax, 活化的caspase3及Bcl-2的表达情况，于术后第28 d，采用免疫荧光观察星形胶质细胞和小胶质细胞激活情况、ELISA 试剂盒检测促炎症因子（IL-1β、IL-6及TNF-α）和抗炎细胞因子（IL-4及IL-10）的表达及。
结果：
（1） CPSP大鼠丘脑VPL区星形胶质细胞和小胶质细胞激活，促炎症细胞因子表达增加，抗炎细胞因子减少，14,15-EET 可抑制星形胶质细胞和小胶质细胞激活，降低促炎细胞因子水平，增加抗炎细胞因子表达，通过抑制丘脑 VPL 区炎症反应，从而缓解CPSP大鼠机械性痛觉超敏反应；
（2） CPSP 大鼠丘脑 VPL 区凋亡相关蛋白增加，抗凋亡蛋白降低，14,15-EET可减轻丘脑VPL区凋亡，从而缓解CPSP大鼠机械性痛觉超敏反应。
结论：
（1） 右侧丘脑VPL出血性卒中可导致双侧足底机械性痛觉超敏反应，同时VPL中14,15-EET的含量及AP的浓度降低，内侧丘脑δGABAAR表达下调；
（2） 14,15-EET通过上调StAR蛋白的表达，进而促进AP的合成，同时增加内侧丘脑δGABAAR的表达，增强AP-δGABAAR信号通路，缓解CPSP；
（3） 14,15-EET 通过抑制炎症细胞激活，降低促炎细胞因子表达，下调凋亡相关蛋白，从而在CPSP大鼠中发挥镇痛作用。