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α-半乳糖苷酶（alpha-galactosidase, EC3.2.1.22）也称蜜二糖酶,在自然界中广泛分布,是催化α-半乳糖苷键水解的一种外切糖苷酶,主要催化水解以α-键结合的半乳糖苷链非还原性末端。因此它具有水解蜜二糖,棉子糖和水苏糖等低聚糖,以及水解含有α-半乳糖苷键杂多糖的能力。已报道的α-半乳糖苷酶主要分布在糖苷水解酶第4,27,36,57等家族中。α-半乳糖苷酶在饲料加工业,医药工业,制糖工业,食品工业等行业中具有非常广泛的应用前景。用于本研究的α-半乳糖苷酶（JmelA）基因是从深海细菌中筛选到的巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）中克隆得到的。JmelA经blast比对是属于第4家族糖苷水解酶（GH4）。JmelA编码440个氨基酸,与来自Bacillus halodurans的α-半乳糖苷酶Me14A具有74%同源性和与来自Citrobacter freundii的α-半乳糖苷酶melA具有46%的同源性。JmelA的理论分子量为50.045kDa,经克隆重组后在Escherichia coli BL21（DE3）菌株中表达。重组JmelA在37℃,50mM Tris-HCl缓冲液的条件下针对不同底物人工合成底物pNPG和棉籽糖等寡糖的最适pH值分别为8.4和9.0；以对硝基苯-a-D-吡喃半乳糖苷（pNP-α-Gal）、棉子糖和水苏糖为底物的Km值分别为1.07±0.03mM,2.33±0.16mM和3.43±0.24mM。对JmelA进行分子结构模拟发现蛋白结构中存在一个隧道结构"tunnel"。为了研究"tunnel"的功能,通过定点突变技术,突变位于隧道表面边缘的Ile38残基和位于隧道内的G1n84残基。通过以对硝基苯基-α-D-吡喃半乳糖苷为底物的动力学测定实验发现I38V和I38A突变体的催化效率（kcat/Km）与野生型相比分别增加了1.6倍和1.4倍,而I38F比野生型催化效率下降3.33倍。另外，突变体Q84A几乎没有活性。结果表明位于隧道"tunnel"结构中的Ile38和Gln84残基对酶活性的影响很显著,通过对突变体对NAD+催化效率曲线,从而得出隧道“tunnel”结构很可能是辅因子NAD+的进出通道。