目前,结核病仍然是威胁人类健康的主要传染病,据世界卫生组织统计,全球每年约有800万人感染结核分枝杆菌,300万人死于结核病。如何有效的预防和控制结核病是人类面临的一个重要课题。通过对一些细菌的研究表明,细菌糖蛋白与细菌致病性密切相关。其作用包括:保持细胞结构稳定性;细胞表面及胞内识别;细胞粘附,调节及维持许多生化特征:如蛋白可溶性,粘度,表面电荷等。由于目前发现的结核分枝杆菌数量有限,所以寻找和发现新的结核分枝杆菌糖蛋白,研究它们的功能和合成途径,对于全面了解结核病的发病机制以及研制新的抗结核药物或疫苗具有重要意义。通过对天然结核分枝杆菌不同组份(包括细胞壁,细胞膜,细胞质,细菌分泌液等)分别进行研究检测,发现只有在胞外分泌液(culture filtrate protein ,CFP)中有糖蛋白的存在。此外,通过研究结核分枝杆菌糖蛋白的合成机制发现,只有底物是经过分泌途径到达胞外的蛋白,才能在甘露糖基转移酶的作用下形成糖基化蛋白,而细胞膜,细胞质内的蛋白则不能进行糖基化。所以依据目前现有的理论,在进行结核分枝杆菌糖蛋白的筛选时,只选择了CFP作为研究对象,而不选择细胞的其它组份。在生物安全3级操净台中,将50%甘油冻存的结核分枝杆菌H37Rv菌株接种到7H11琼脂糖平板上,37℃孵箱中生长2周。挑取平板上单个菌落接种到10ml 7H9液体培养基中,37℃振摇培养2周。将10ml菌液再转移到1L的GAS液体培养基中。接种后的细菌于37℃孵箱中以100rpm的速度振摇培养。约10-14天后,监测细菌培养液OD600值,当细菌OD600值达到0.6～0.8时,取出培养瓶。4℃离心收获上述细菌,转数3000rpm,离心15mins,将沉淀的细菌再溶于100ml GAS培养基中(不含有土温),然后平均接种到10个各含有1L GAS培养基的培养瓶中,继续于37℃孵箱中以100rpm振摇培养2周。2周后,停止培养,取出菌液,将培养瓶静置,细菌沉淀,用50ml吸管于操净台中将细菌吸出,将余下的上清液经0.2μm Zapcap过滤器经负压吸引过滤除菌,用3个容积为4L的高压灭菌的收集瓶收集滤液,得到粗提的CFP。于4℃冷库中将约10L的CFP粗提液倒入Amicon容器中,打开氮气罐阀门,在持续的压力作用下(最大压力不能超过60 psi),Amicon容器中的CFP会自动缓慢流入到过滤浓缩装置中,该装置内的磁力搅拌棒缓慢搅动,防止有沉淀产生。此时,分子量大于3kDa的蛋白成分得到保留,而小的分子会被滤除,使粗提的CFP得到浓缩。大约48～72小时后,10L的CFP会浓缩到10～50ml左右。在此过程中,压力保持一致,装置接口处密闭。将浓缩的CFP转移到透析袋(3kDa)中,于4℃冷库中透析。透析液为8L的10mM的碳酸氢胺。每8h更换一次透析液,共更换3次。采用BioRad 680微板阅读器(波长550 nm)BCA法检测蛋白浓度。用ConA结合缓冲液将蛋白样品CFP浓度稀释到1mg/ml; ConA琼脂糖4B树脂装柱,将10ml样品缓慢加到柱内,用5倍柱体积的ConA洗脱液洗脱柱上结合的蛋白样品,流速为1ml/min;收集洗脱部分;将收集到的样品放到透析袋(可截留分子量大于3.5kD的蛋白质)中,于4℃下透析,透析液为8L的10mM碳酸氢铵;每8小时更换一次透析液,共换3次;可以除去样品中的糖和盐。经BCA检测蛋白浓度。纯化后的糖蛋白通过15%SDS-PAGE,将糖蛋白根据分子量的大小分离开来。通过考马斯亮蓝染色初步确定不同糖蛋白的分子量。记录分子量大小,将6条蛋白条带用刀片切下,并割成碎片,经过脱色,抽提,最后用测序级胰蛋白酶于37℃孵箱中过夜消化,离心取上清,经真空干燥后加入质谱上样缓冲液,再次离心弃去沉淀部分,即用于质谱分析。经酶切消化的蛋白形成多肽或糖肽,首先采用高效液相色谱法将不同成分分离。色谱柱采用的C-18反相柱,可以根据极性的不同将多肽分开。自动进样针每次取5μl样品。流动相包括缓冲液A(三氟乙酸:水=0.1:99.9)和缓冲液B(三氟乙酸:水:乙腈=0.1:9.9:90),流速:5ul/min,每次样品进样5ul(缓冲液为5%乙腈,95%双蒸水,0.1%乙酸缓冲液)。梯度洗脱方案:流动相首先为98%缓冲液A和2%缓冲液B,然后逐渐过渡到8%缓冲液A和92%缓冲液B。时间为1h。缓冲液pH值为7.4。质谱仪为电喷离子阱质谱仪,离子源电压为4KV, CID为35%。采用软件Xcalibur分析HPLC及己糖断裂丢失情况。MS对蛋白糖基化的判断主要是依据不同糖肽/多肽质核比(m/z)之间的差值。而这个差值是由于糖分子的脱落以及离子化后分子携带的电荷的多少所决定的。由于目前所发现的结核分枝杆菌糖蛋白的糖基部分均为己糖,其分子量为162AMU(atomic molecular unit)。所以每失去一个糖分子,多肽的分子量将减少162;失去2个糖分子,分子量则减少324,依此类推……同时,由于HPLC分离的多肽片段在经质谱仪中的离子源电喷雾形成离子后,可以携带1,2,3,4等多个电荷,所以每一个带有离子的多肽片段便会有其特征性的质量电荷比,即m/z。因此如果某一多肽被糖基化,在失去一个或多个糖分子后,不同多肽之间的m/z的差值便是162*n/z(n为失去糖分子的数量,z为电荷数),所以在质谱图上会规律性的出现m/z相差为162,81,54,40.5…...的多肽峰。应用软件Xcalibur,分别在m/z减少为162、81、54、40.5的质谱图上挑选主要的峰,分析它们的MS,MS/MS(MS2),MS/MS/MS(MS3)。采用软件Bioworks,结合结核分枝杆菌蛋白数据库分析,比对氨基酸序列,查找相应的蛋白。实验中共收获了9.5L的CFP,经过72小时的超滤浓缩,得到20ml CFP,经透析后检测蛋白浓度为1.2mg/ml。CFP经ConA亲和层析纯化后,蛋白浓度为0.mg/ml。进行SDS–PAGE电泳后经考马斯亮蓝染色显示6条蛋白带,相对分子量分别约75 kDa、65 kDa、47 kDa、26 kDa、16kDa、12kDa。尽管理论上经ConA亲和层析纯化后的蛋白均应为糖蛋白,但由于某些非特异性结合的蛋白可能混杂其中,需要采用HPLC-MS进一步分析。酶切后的样品HPLC结果提示:基线平稳,多肽均得到有效分离,色谱行为良好。应用软件Xcalibur及Bioworks分析质谱结果。结果发现在样品12kDa、16kDa、65kDa、75kDa中,或者未发现己糖的脱落,即规律性减少的m/z(162、81、54、40.5);或者即便有己糖的脱落,但未找到蛋白结构。47kDa为已经发现的糖蛋白ModD。只有26kDa为一可能的新的糖蛋白。应用Xcalibur软件逐个分析26kDa在HPLC中的多肽峰,发现保留时间为24.65 min的多肽片段总分子量为1467 AMU。经MS/MS二级扫描,可见该多肽的m/z逐级减少54( ?54)的信号峰出现(1413.08→1359.19→1305.20)。经MS/MS/MS三级扫描,仍可见m/z逐级减少54(?54)的信号峰出现(1359.54→1305.47→1251.04→1196.92→1142.92→1089.33→1034.96→981.18)。这说明在24.65min这一时间点,出现了己糖从离子上脱落的现象,故该离子可能为单纯的糖类或糖基化的多肽,需要进一步寻找蛋白结构的证据。采用Bioworks分析软件,结合结核分枝杆菌蛋白数据库,得到上述多肽的氨基酸序列为:HVPGHTGTPASGDLASL,该多肽含有O连接的糖基化位点:即苏氨酸(T)或丝氨酸(S),而且在T或S的邻近部位有脯氨酸(P)或丙氨酸(A),这些均是O连接糖蛋白的特点。将上述氨基酸序列与结核分枝杆菌H37Rv蛋白数据库中的蛋白序列进行比对,发现可能的蛋白共有4个,分别为铜‐锌超氧化物歧化酶(superoxide dismutase Cu-Zn ,SodC); GltA2; Acn;未知蛋白。但是只有铜‐锌超氧化物歧化酶的结构与上述多肽链结构的相关性积分最高,其分子量为23.8kDa,与预期的26 kDa接近(蛋白数据库中的蛋白分子量不包括糖苷部分),而其他3个蛋白不仅相关性积分较低,而且分子量远远大于26 kD,因此,综合上述分析,结核分枝杆菌蛋白铜‐锌超氧化物歧化酶(SodC)应是一个新的糖蛋白。目前结核分枝杆菌中糖蛋白发现的数量很少,对于其合成途径以及功能的了解也非常有限,但是考虑到糖蛋白在真核生物以及其他细菌中的重要作用,人们普遍认为发现和寻找新的结核分枝杆菌对于结核病的研究将具有重要意义。本实验采用ConA结合HPL-MS/MS,找到了两个糖蛋白,其中一个为已经发现的糖蛋白modD,另一个为新的结核分枝杆菌糖蛋白即铜‐锌超氧化物歧化酶。尽管本实验发现的糖蛋白数量不多,但是由于糖蛋白的鉴别非常困难,如由于糖蛋白中糖苷的存在,往往出现SDS-PAGE上染色偏淡而不容易被发现,或者影响多肽在反相柱中的有效分离等,这些都是制约糖蛋白发现的不利因素。但是尽管如此,本实验方法最终成功的筛选到了糖蛋白,尤其是发现了新的糖蛋白,这对于收集糖蛋白的信息,丰富结核分枝杆菌糖蛋白的数据库,以及进一步进行糖蛋白组学的研究具有重要意义。