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研究背景和目的:自身免疫性溶血性贫血（autoimmune hemolytic anemia,AIHA）是一种相对罕见的由于自身抗体联合或不联合补体导致红细胞加速破坏且临床表现存在高度异质性的疾病。其他致病机制包括细胞免疫效应器过度的活化、细胞因子的失调和骨髓造血的失代偿,尚未有研究在单细胞转录组和免疫组水平对AIHA治疗前后的生物学特征进行探究。目前,虽然糖皮质激素单药或联合利妥昔单克隆抗体（RTX）作为AIHA的一线治疗方案及以RTX为主的二线治疗方案可以使70-80%患者获得疾病缓解,但超过25%的患者将再次复发。脾切除术及其他免疫抑制剂疗效不确切且毒副反应较大,无法在临床中广泛使用。因此,建立复发/难治型AIHA的挽救治疗策略,寻找新的高效且低毒副反应的治疗药物是亟待解决的临床问题。此外,利用单细胞转录组学技术解读复发/难治型AIHA治疗前后的生物学特性有助于探索新的靶向治疗方案,提高靶向治疗有效率,合理规划靶向治疗时间,减少疾病复发几率。方法:首先,我们回顾性分析了 2019年8月至2022年1月期间就诊我中心接受RTX治疗的34例AIHA患者的临床特征和疗效。其次,我们设计了一项评估伊布替尼治疗复发/难治型AIHA有效性和安全性的Ⅱ期临床试验（NCT04398459）,目前已完成12例入组患者的疗效和安全性评估。最后,我们对伊布替尼治疗队列4例患者治疗前后以及3例健康对照的外周血样本共计77829个单个核细胞进行单细胞转录组及V（D）J建库并对测序数据进行分析。所有数据分析应用R语言（3.6.3版本）,Graphpad Prism（8.0.2版本）和SPSS（23.0版本）软件完成,连续性变量符合正态分布使用平均值、标准差、t检验,符合偏态分布使用中位数、四分位数、秩和检验进行比较,分类变量使用卡方检验或Fisher精确检验,使用Kaplan-Meier法绘制无复发生存（relapse free survival,RFS）曲线,存在统计学差异需满足双侧P＜0.05。结果:1.RTX治疗队列疗效分析:33例RTX治疗的患者中,中位年龄32（6-69）岁,治疗前Hb值为81（35-141）g/L,总有效率（ORR）为81.8%,其中CR及CRi率为60.6%（20/33例）。RTX治疗中位起效时间为4（1-14）周,27例有效患者中位随访时间9.5（2-30）月,中位RFS 11.5（6.7-未到）月。亚组分析:AIHA组（27例）患者治疗前Hb为72g/L明显低于Evans组（6例,Hb 104g/L,P=0.001）且RTX 治疗的 RFS 明显延长（12.3 月对 5.8 月,HR=2.68（0.75-9.51）,P=0.041）。RTX标准治疗剂量与小剂量组患者的RFS无明显变化。RTX治疗安全性尚可,感染发生率27.3%,其中3-4级感染24.2%,中位感染发生时间为11（1-14）周。2.伊布替尼治疗队列疗效分析:接受伊布替尼治疗13例患者中,单纯AIHA 12例（温抗体型8例,温冷双抗体型2例,Coombs阴性2例）,Evans综合征1例。患者中位年龄30（6-64岁）,治疗前中位Hb67（24-88）g/L。可评价疗效的12例患者,ORR为66.6%,CR和CRi率为58.3%（7/12例）,伊布替尼治疗的中位起效时间为5.3（1-10）周,治疗后患者的Hb值明显升高（P=0.03）,LDH值明显降低（P=0.012）。与伊布替尼治疗有效组患者相比,无效组治疗前C3水平相对更高（无效组0.855g/L对有效组0.695g/L,P=0.008）,对疗效具有良好的预测效力（ROC曲线下面积为1）。伊布替尼治疗安全性良好,3-4级不良反应主要为中性粒细胞减少2例、感染2例、变异性血管炎1例和皮疹2例,余不良反应轻微。3.单细胞测序分析:通过对伊布替尼治疗前AIHA患者及健康对照样本的单细胞转录组测序数据的聚类和注释,我们鉴定出20群免疫细胞,AIHA样本中DC2、巨噬细胞、NK细胞比例降低,而γδTRDV1、XCL-TE细胞比例升高,两组样本相关性分析提示CD8-TE、CD8-EM、γδTRDV2-TRDV9、单核细胞细胞群存在较大差异,根据两样本中差异较大细胞群以及整体的差异基因对比,最终找到617个差异基因,以上调基因为主,主要在T细胞活化、对INF-y反应、蛋白磷酸化、B细胞活化、NK细胞介导细胞毒、NF-κB信号通路、B细胞受体信号通路、IL-17信号通路、TNF信号通路、JAK-STAT及PI3K-ARK信号通路等自身免疫反应相关的多条信号通路中富集。伊布替尼治疗后上述T细胞活化及自身免疫反应相关通路明显下调。然而,伊布替尼治疗无效的样本中,上述T细胞活化、抗原形成和提呈以及多条自身免疫反应的信号通路虽较治疗前有一定程度降低,但仍呈现上调状态。此外,我们对不同样本的单细胞免疫组数据分析后发现,AIHA患者的TCR呈现寡克隆数量增多,克隆多样性降低,CDR3区氨基酸长度增加的倾向,应用伊布替尼治疗后可以改变患者TCR克隆情况,但治疗无效患者改善不明显。AIHA患者出现TCRα链的TRAV7基因片段缺失,而特异性使用TRAJ25、TRBV5-7、TRBV6-9及TRBV7-4基因片段,且治疗后患者高频使用基因片段也发生了明显变化。结论:RTX治疗初诊或复发AIHA有效率高,但治疗后复发和6月内的感染率不容忽视。伊布替尼治疗复发/难治型AIHA近期疗效显著,仍需要继续扩大样本量、延长随访时间检测远期疗效。单细胞转录组测序提示复发/难治型AIHA患者存在T细胞活化、蛋白自磷酸化以及多条自身免疫相关通路上调,TCR克隆多样性减少,应用伊布替尼治疗可以一定程度上控制T细胞活化以及活化的自身免疫相关通路,部分恢复TCR克隆多样性。然而,伊布替尼治疗无效的患者存在过度的T细胞活化、Th细胞分化、Treg失衡以及TCR克隆趋向寡克隆、多样性降低的情况。因此,本研究为临床上治疗复发/难治型AIHA患者带来新的方法,也为研究者针对靶向B细胞治疗无效患者设计其他的治疗方案提供新的思路。急性髓系白血病（Acute Myeloid Leukemia,AML）是一种高度基因异质性的造血干细胞恶性肿瘤性疾病,预后极差。我们通过下载并分析癌症基因库（The Cancer Genome Atlas,TCGA）和基因型-组织表达（Genotype-Tissue Expression,GTEx）数据库的RNA测序信息寻找有预后作用的核心分子。首先,DC-STAMP在AML患者中表达显著增高,且与老年、不良细胞遗传学与后及死亡相关（P＜0.05）。其次,通过单因素（风险比[Hazard Ratio,HR]:2.683;95%置信区间[Confidence Interval,CI]:1.723-4.178;P＜0.001）及多因素分析（HR:1.733;95%CI:1.079-2.781;P=0.023）提示DC-STAMP高表达对于AML总生存（Overall Survival,OS）是独立预后不良因素。对DC-STAMP表达与预后相关性分析（一致性指数[Concordance index,C-index]0.734,95%CI:0.706-0.762）、校准曲线以及决策曲线分析均印证了高表达DC-STAMP对于AML不良预后的作用效力。再次,我们对DC-STAMP高表达组与低表达组的差异表达基因（Differentially expressed genes,DEGs）进行基因本体论（Gene Ontology,GO）和京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）富集分析,主要在通道活化和血小板α颗粒相关通路,而基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis,GSEA）提示 DEGs 主要富集在 mTORCl、TNF-α、NF-KB信号通路。进一步对DEGs进行蛋白质相互作用（Protein-Protein interaction,PPI）分析,提示DC-STAMP与PPBP、PF4两个枢纽基因存在相互作用,且后者高表达均与生存期缩短相关。最后,DC-STAMP高表达还与4种免疫细胞浸润（NK CD56 dim cells,巨噬细胞,细胞毒细胞,CD8+T细胞）以及免疫检查点基因（PDCD1,CD274,CTLA-4,TIGIT）高表达密切相关。因此,本研究提示DC-STAMP高表达提示白血病不良预后。