论文部分内容阅读
三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus),隶属于节肢动物门(Arthropoda)、甲壳纲(Crustacea)、十足目(Decapoda)、梭子蟹科(Portunidae)、梭子蟹属(Portunus),是我国重要的海产经济蟹类。海洋水生甲壳动物主要依靠两种不同的渗透压调节机制,即非等渗细胞外调节(AER)和等渗细胞内调节(IIR)。IIR主要是通过Na+-K+-泵调节机体无机离子的含量,而IIR主要借助于游离氨基酸(free amino acids,FAAs)含量的变化从而调节机体的渗透压,相比AER调节方式,FAAs有利于维持机体内环境的稳定。研究内容包括以下三部分第一部分:盐度胁迫对三疣梭子蟹鳃,肌肉,血淋巴中游离氨基酸(Free amino acids,FAAs)含量变化的影响。结果显示:肌肉中含量最高,其次为鳃,血淋巴含量最低。三个组织中总游离氨基酸(total free amino acid,TOFAA)的含量与外界盐度呈正相关(P<0.05),发挥渗透压调节作用的FAAs主要为Ala,Glu,Gly,Pro。Pro在高盐环境渗透压调节方面均表现出主导作用,因此,研究Pro的代谢通路对梭子蟹高盐适应有重要意义。第二部分:盐度胁迫对三疣梭子蟹谷氨酸脱氢酶(Glu dehydrogenase,GDH)的基因表达以及酶活性影响的分析。该部分主要验证GDH作为Pro代谢通路的上游关键酶,对Pro含量的调控作用。Real-Time PCR和酶活结果分析显示:高盐促进了GDH的表达,但活性受到显著地抑制。因此结果表明Pro的合成主要受到自身代谢通路的调控,而非简单的由GDH的控制。第三部分:盐度胁迫对三疣梭子蟹Pro三条代谢通路中三个关键基因的分子水平和蛋白水平变化的研究。首先,对Ornithine途径中的鸟氨酸氨基转移酶(Ornithine aminotransferase,OAT)的分析。采用RACE方法获得OAT的c DNA全长为1754bp,其中开放阅读框1317bp,编码438个氨基酸。同源性分析表明与捕食螨(Metaseiulus occidentalis)的OAT氨基酸序列同源性最高,Real-Time PCR和酶活结果显示:高盐和低盐显著抑制了OAT的表达和酶的活性。因此本实验表明,OAT对盐度变化较敏感,Ornithine途径可能不是梭子蟹盐度胁迫下合成Pro的主要途径。其次,对另一条合成途径Glu途径中Δ1-吡咯林-5-羧酸合成酶(Δ1-pyrroline-5-carboxylate synthetase,P5CS)分析。Real-Time PCR和酶活结果显示:盐度对P5CS的表达没有显著地影响,但是酶活性变化与外界盐度表现正相关性(P<0.01)。因此,结果表明盐度胁迫下P5CS在合成Pro起主要作用,Glu途径为合成Pro的主要合成途径。最后,探究Pro唯一一条分解途径中的关键基因-脯氨酸脱氢酶(Proline dehydrogenase,Pro H)对盐度变化的适应情况。采用RACE方法获得三疣梭子蟹Pro H的c DNA全长为2162bp,其中开放阅读框1890bp,编码629个氨基酸。同源性分析表明与厩螫蝇(Stomoxys calcitrans)的Pro H氨基酸序列同源性最高。Real-Time PCR和酶活结果显示:Pro H的表达量和酶活变化与外界盐度呈负相关,其发挥的作用与Pro含量的变化相吻合,表明盐度胁迫下Pro H对于梭子蟹Pro含量的积累作用显著。