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恶性骨肿瘤起源于中外胚层的间叶组织,在临床上总体发病率不高,但大都具有高度恶性,容易发生肺部转移,患者预后较差。近年来虽然手术方式及化疗药物在不断改善,但收效甚微。造成这种现象最主要的原因是恶性骨肿瘤患者对目前的治疗(主要是化疗)不敏感。目前有关恶性骨肿瘤抗药性和复发的调控机制我们还知之甚少,有人认为导致治疗失败的原因是恶性骨肿瘤中可能存在一小部分细胞具有某些干细胞特征(自我更新,高抗药性,高侵袭性),从而最终导致肿瘤的转移和复发。这个观点恰好与目前肿瘤研究领域中最前沿的肿瘤干细胞(cancer stem cell, CSC)理论相符合。肿瘤干细胞理论认为肿瘤中存在一小部分具有高抗药性的细胞,这些细胞与正常成体干细胞一样具有自我更新能力,能产生不同类型的后裔细胞以构成肿瘤组织。该理论可以很好的解释目前治疗中肿瘤抗药性和复发的原因,靶向治疗肿瘤干细胞已引起人们极大地兴趣。尽管在很多类型的肿瘤中都已证实存在肿瘤干细胞,但有关恶性骨肿瘤的肿瘤干细胞研究却鲜有报道。这可能是到因为目前为止还没有公认的恶性骨肿瘤特异性表面标志。不过干细胞的另一种特性(高效外排DNA染料Hoechst 33342)也可以用来分离具有干细胞特征的细胞,采用此方法可以分离出一小部分侧群(side population,SP)细胞。现已在多种类型的肿瘤组织和细胞系中分离出SP细胞,并证实SP细胞具有许多与干细胞相似的特征,这些都提示SP细胞中富含肿瘤干细胞,但有关恶性骨肿瘤SP细胞研究却很少有报道。因此,我们选择了人恶性骨肿瘤中具有代表性的骨肉瘤和尤文氏肉瘤作为实验对象,分别从细胞系和原代肿瘤组织中分离SP细胞并鉴定其各项生物学特性,希望可以证实恶性骨肿瘤SP细胞具有干细胞特征。(一)骨肉瘤和尤文氏肉瘤SP细胞的分离我们成功的在人尤文氏肉瘤细胞系SK-ES-1中找到并分离出SP细胞,SP细胞所占比例为约1.2%。而在人骨肉瘤细胞系MG63中无法找到SP细胞;但我们在骨肉瘤临床标本中证实存在SP细胞,总共我们分析了6例标本,其中5例都发现存在SP细胞(OS1–OS5),SP细胞比例从3.7%到10.2%。(二) SP细胞与non-SP细胞各种生物学特性差异研究1.再生细胞群能力在体外SK-ES-1的SP细胞可以同时生成SP和non-SP细胞,而non-SP细胞只能分裂产生non-SP细胞;OS1–OS5的SP细胞在体内和体外都可以同时生成SP和non-SP细胞,但non-SP细胞在体内和体外生成大量non-SP细胞的同时也会产生数量很少的SP细胞。2.生长曲线SK-ES-1的SP细胞群的生长曲线与non-SP细胞群的生长曲线在形状上相似,二者都有对数生长期。并且SP细胞群和non-SP细胞群的分裂增殖速度并没有明显的差别;OS1–OS5的SP和non-SP细胞的生长曲线在形状上与正常细胞的生长曲线类似,都具有对数生长期,但前3-4天non-SP细胞生长速度似乎要快于SP细胞。3.体外克隆形成能力和侵袭性SK-ES-1和OS1–OS5的SP细胞都表现出明显高于non-SP细胞的体外克隆形成能力,而non-SP细胞与未经Hoechst 33342染色的原始细胞的体外克隆形成能力没有显著的差别;同时我们也发现体外SK-ES-1 SP细胞比non-SP细胞更具侵袭性。4.裸鼠体内成瘤能力OS1和OS5的SP细胞在裸鼠体内表现出高致瘤性,同时non-SP细胞也表现出一定的致瘤性;但只有SP细胞具有自我更新能力:在连续移植实验中只有SP细胞能保持致瘤性,non-SP细胞无法成瘤,并且SP细胞的第二次异种移植瘤与原代肿瘤以及第一次异种移植瘤都具有相同的组织病理学细胞形态。5.抗药性化疗药物阿霉素(doxorubicin)和顺铂(cisplatin)对SK-ES-1 SP细胞的IC50明显高于对non-SP细胞的IC50;阿霉素(doxorubicin),顺铂(cisplatin)和甲氨蝶呤(methotrexate)对OS1,OS2和OS5 SP细胞的IC50明显高于对non-SP细胞的IC50(除OS1顺铂组,OS5顺铂和甲氨蝶呤组)。这些都提示SP细胞比non-SP细胞具有更高的化疗药物提抗性。6.“干”性基因表达通过RT-PCR分析我们发现SK-ES-1和OS1–OS5的SP细胞中ABC转运家族基因表达上调,尤其是ABCG2,在所有检测的SP细胞中全部高表达;此外,Oct-4和Nanog在OS1–OS5的SP细胞中表达也上调。综上所述,我们成功的在恶性骨肿瘤中分离出SP细胞,并通过对其的各项生物学特性研究证实恶性骨肿瘤SP细胞具有多项肿瘤干细胞特征,例如多种分化能力,高致瘤性及体外克隆形成能力,自我更新能力,高抗药性以及“干”性基因高表达。这些都提示恶性骨肿瘤SP细胞中富含干细胞样细胞,在肿瘤的发生和发展过程中起关键作用。本研究填补了恶性骨肿瘤肿瘤干细胞的研究空白,为恶性骨肿瘤治疗中进一步靶向SP细胞奠定了理论基础。