苹果砧木不定根发生相关miRNA筛选鉴定与表达分析

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当前,我国苹果产业正在由乔砧密植向矮砧密植变革的关键时期,由于我国苹果栽培生态类型多样,具有优良生态适应性矮化砧木的选育至关重要,但目前我国广泛推广的自主选育的SH系等矮化砧木生根能力差,生产上多以矮化中间砧方式被利用。植物miRNA 介导的基因表达调控在器官形态建成、激素信号转导以及逆境响应等多种生理过程中起重要作用,但有关miRNA参与调控苹果砧木不定根发生的研究还很薄弱。本研究以不同生根能力典型苹果砧木‘SH6’(难生根)、‘T337’(生根能力中等)和‘圆叶海棠’(易生根)为材料,通过miRNA组结合降解组测序,以期挖掘不定根(Adventitious root,AR)发生相关miRNA,揭示miRNA介导的苹果砧木不定根发生的调控网络,为深入研究奠定基础。主要结果如下:  1.对苹果砧木‘T337’不定根发生过程的3个时期构建了共9个miRNA文库,通过高通量测序筛选了参与不定根发生调控的关键 miRNA。利用降解组测序对部分miRNA进行了靶基因的验证。提出了苹果砧木不定根发生在miRNA水平可能的调控网络,发现这些miRNA通过调控植物激素信号、逆境响应、细胞活动等生理活动参与不定根的发育。其中包括:miR390 , miR160 调控 ARFs 参与植物生长素信号转导;miR398a-CSD2参与活性氧代谢,miR395-APS1参与植物缺素反应,miR408响应逆境信号, miR398b-PYL 参与 ABA、JA 信号通路调控;miR156-SPLs , miR319-TCPs , miR396-GRFs,miR166-ZIPs,miR171-GRAS 参与细胞命运转变、细胞分裂、细胞分化的调节。这些miRNA与靶基因共同构建起多基因参与、多通路涉及的复杂调控网络。  2.对不同植物材料的 miR396 家族进行了研究,发现该家族在不同材料间的序列较为保守,物种间进化关系也较近,且均能形成较稳定的茎环二级结构。对其7个家族成员共4种成熟体序列研究发现,它们发生剪切的位点不同,但是靶基因GRFs上的裂解位点都在WRC结构域内。miR396a和miR396f在不定根发生过程中的表达模式不同, miR396a在1-3 d时明显促进不定根发生,而miR396f在该时期下调,在4-7 d对不定根发生起正调控作用。推测二者对不定根发生调控机制存在差异。在不定根发生中起到主要调节作用的靶基因成员是GRF1和GRF5,其中GRF1在诱导期和伸长期起作用,GRF5则主要调控萌发期的细胞活动。  3.对9个miRNA文库和降解组文库进行筛选得到7个可能的苹果novel miRNA。通过克隆得到它们的前体序列,验证了其茎环二级结构的存在。通过序列比对发现,这些novel miRNA有些可能是已知miRNA家族的新成员,有些则可能是未被发现的新miRNA。它们的靶基因包括 CYPs、TCPs、BSK2、SPLs 等多种调节植物生长发育、响应激素信号的基因。在不定根发生过程中的表达分析显示,这些novel miRNAs大多在不定根诱导期差异表达,在一定程度上调控了不定根的发生。对这些novel miRNA还有待进一步更加深入的研究。  综上,本研究初步构建了苹果砧木不定根发生过程的miRNA-靶基因调控网络图,在miRNA水平探讨了不定根发生可能的调控机理。
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