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半胱氨酸蛋白酶是生物体内蛋白水解的主要参与者，参与了生物体的细胞凋亡、组织降解、免疫防御等过程。家蚕半胱氨酸蛋白酶抑制剂(BmCPI)作为家蚕半胱氨酸蛋白酶(BCP)的专性抑制剂在机体调控方面发挥了重要的作用，昆虫在其变态发育中都有半胱氨酸蛋白酶及其抑制剂的参与。 半胱氨酸蛋白酶抑制剂广泛地分布于动物，植物以及微生物当中，它可以占据半胱氨酸蛋白酶活性中心，形成紧密的复合物，以此抑制半胱氨酸蛋白酶的活性。昆虫中对半胱氨酸蛋白酶抑制剂的研究较少，本研究主要通过基因克隆，原核表达，Western Blot，免疫组化，双荧光素酶报告系统，定点突变，进化分析等方法对家蚕体内的半胱氨酸蛋白酶抑制剂(BmCPI)进行鉴定，并对其在家蚕体内的分布及表达调控方式进行探究，为深入研究半胱氨酸蛋白酶抑制剂在家蚕变态发育中的作用提供数据支持。主要研究结果如下: 1、家蚕半胱氨酸蛋白酶抑制剂克隆、表达、纯化及抗体制备 利用家蚕全基因组数据库以及NCBI对家蚕体内的半胱氨酸蛋白酶抑制剂进行比对，发现家蚕中两个编码I29抑制剂家族的半胱氨酸蛋白酶抑制剂的基因，分别命名为BmCPI39和BmCPI40，其中BmCPI39编码105个氨基酸，成熟体大小约为11.16 KD，等电点约为6.09; BmCPI40编码121个氨基酸，成熟大小约为13KD，等电点约为4.39，两者成熟体都不含半胱氨酸，无二硫键。亲缘关系上BmCPI39和BmCPI40和家蚕NPV病毒体内的半胱氨酸蛋白酶较近。 对BmCPI39和BmCPI40基因序列进行克隆、表达，同时得到BmCPI39和BmCPI40的可溶性蛋白，进一步对其进行纯化，得到的高纯度蛋白制备多克隆抗体。效价检测显示BmCPI39和BmCPI40的抗体效价均高于1∶512，000，浓度分别为1.62 mg/ml和1.25 mg/ml，进一步的抗体特异性检测显示BmCPI39和BmCPI40的多克隆抗体均可与抗原特异性结合，制备的抗体可用于后续实验。 2、重组家蚕半胱氨酸蛋白酶抑制剂的活性测定及关键氨基酸检测 对重组BmCPI39和BmCPI40活性测定结果显示，重组的BmCPI39和BmCPI40能够有效的抑制组织蛋白酶L的活性。圆二色谱(CD)扫描结果显示，重组的BmCPI39和BmCPI40具有极高的热回复性。对BmCPI39和BmCPI40所编码的蛋白质进行三维结构预测及定点突变，发现BmCPI39第45位的精氨酸在维持其完整的三维结构上起到重要的作用。 3、家蚕半胱氨酸蛋白酶抑制剂的表达特征及组织定位 核酸水平上检测家蚕5龄第3天各组织以及各时期BmCPI39和BmCPI40的表达情况，RT-PCR及Q-PCR显示， BmCPI39主要在血淋巴中表达，BmCPI40在体壁中表达量较高。Q-PCR检测时期表达显示，BmCPI39在眠期及变态期表达量上升，且蛹期表达量高于幼虫期，BmCPI40基本呈相反表达模式，在眠期及变态期BmCPI40表达量下调，幼虫期表达量高于蛹期。家蚕5龄第3天及各时期蛋白水平的Western Blot检测结果基本与核酸水平检测结果相一致。免疫荧光的结果显示BmCPI40主要存在于家蚕体壁的表皮层及皮细胞层，由皮细胞向外周分泌。 4、家蚕半胱氨酸蛋白酶抑制剂表达调控初探 20E诱导家蚕后发现，血淋巴中BmCPI39的表达量明显上升，体壁中BmCPI40的表达量则降低，证实BmCPI39及BmCPI40都受到蜕皮激素的调控。双荧光素酶报告系统检测家蚕BmE细胞中BmCPI39启动子和BmCPI40启动子在20E诱导后活性变化，结果显示，BmCPI39和BmCPI40二者的启动子活性在20E诱导下均下降。