金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,金葡菌)是医院和社区获得性感染的主要病原菌,致病性较强。由于抗生素及其他抗菌药物的选择性压力,金葡菌形成多种耐药性策略。耐药性病原菌的进化及蔓延,尤其是超级耐药菌株的出现,对感染性疾病的治疗以及人类的健康提出了严峻的挑战。因此,当务之急是寻找并研发治疗细菌感染的新策略。金葡菌致病性的强弱主要取决于其所产生的各种毒力因子。金葡菌血管性血友病因子结合蛋白(vWbp)是影响金葡菌致病性的重要毒力因子,可将血液或者血浆中的纤维蛋白原转化为纤维蛋白,沉积于菌体表面,加速凝血过程,同时形成的纤维蛋白屏障可抵抗宿主自身免疫系统的清除,促使感染局限化形成脓肿病灶以及血栓形成。此外,vWbp可促进金葡菌在导管表面的黏附以及肾脓肿形成。因此,以vWbp为抗毒力靶点,开展相关抑制剂的研究具有重要意义。抗毒力化合物与传统的抗菌药物截然不同,不影响细菌本身的生长活性,主要通过靶向金葡菌的毒力因子从而降低病原菌致病性。抗毒力化合物可使侵入的细菌处于易感状态,从而增强宿主自身的免疫清除作用和抗菌或杀菌活力。绵马贯众素是从鳞毛蕨科植物绵马贯众(Dryopteris crassirhizoma Nakai)根茎和叶柄中分离出的一种间苯三酚衍生物,具有驱虫、抗病毒、抗肿瘤等多种药理作用,还具有抗菌活性。但对于其能否通过影响vWbp活性,影响金葡菌致病性仍不可知。实验目的:本实验以金葡菌vWbp为药物作用靶点,从200种中药单体中筛选出其有效抑制剂即绵马贯众素,并研究该抑制剂对vWbp蛋白活性及金葡菌体外导管感染模型和金葡菌感染小鼠肾脓肿的影响。从而为以vWbp作为治疗靶点,通过绵马贯众素降低金葡菌致病力提供理论依据。实验方法:1.本研究首先构建含有vWbp基因的过表达载体vWbp-p ET15b,用IPTG诱导表达,并用Ni柱亲和层析纯化目的蛋白;2.vWbp抑制剂筛选:通过金葡菌试管凝血实验,从200种中药单体中筛选无明显抑菌活性的vWbp抑制剂,选取抑制效果较好的中药单体即绵马贯众素作为后期实验的研究对象;3.通过绘制绵马贯众素作用下金葡菌Newman的生长曲线,研究该中药有无抑菌或杀菌活性;并通过蛋白免疫印迹研究该中药能否影响vWbp蛋白的表达水平;利用金葡菌试管凝血实验以及琼脂糖平板实验,进一步研究该中药对vWbp蛋白活性的影响;4.通过DARTS(Drug Affinity Responsive Target Stability)实验和Thermal Shift Assay实验研究绵马贯众素与vWbp之间能否直接相互作用;5.通过构建金葡菌体外导管感染模型和体内金葡菌感染小鼠肾脓肿模型,研究绵马贯众素对金葡菌感染的实际治疗效果。实验结果:1.重组载体vWbp-p ET15b双酶切后,在1527 bp处和5700 bp左右处各出现一条带;SDS-PAGE结果显示诱导后较诱导前在66 k Da处出现一条差异明显的条带,经Ni柱亲和层析后在66 k Da处出现单一条带。2.金葡菌试管凝血实验结果显示:vWbp的阳性对照组10 min内就已完全凝固,绵马贯众素加药组能够明显延长凝血时间,直至4 h才凝固。3.绵马贯众素作用下金葡菌的生长曲线与野生菌株无明显差异;Western blot结果显示:随着绵马贯众素浓度升高,vWbp蛋白表达量没有明显变化。4.DARTS结果表明:随着绵马贯众素浓度的增加,SDS-PAGE上残留vWbp蛋白量随之增加,Protase E对vWbp的消化作用则降低。反之,没有加药组,vWbp蛋白则被消化完全。5.Thermal Shift Assay结果显示:绵马贯众素作用下,vWbp的Tm值与没有加药组相比,升高11℃,远远大于2℃(差异>2℃即认为小分子与蛋白具有较强相互作作用)。6.金葡菌体外导管感染模型的扫描电镜结果显示:绵马贯众素作用下,粘附到导管表面的金葡菌大幅度降低,形成的纤维蛋白类的生物基质也明显减少。7.金葡菌感染小鼠肾脓肿模型的病理学研究显示:野生金葡菌组可看到有明显脓肿形成;而vWbp敲低组(△vWbp),肾脓肿大幅度减少,几乎没有脓肿形成;绵马贯众素作用组与△vWbp组作用效果相似。实验结论:1.绵马贯众素512μg/m L不抑制金葡菌的生长,且不影响vWbp蛋白表达。2.绵马贯众素对vWbp的凝血活性有明显抑制作用,存在剂量依赖性。3.绵马贯众素可直接与vWbp相结合,影响其活性及热稳定性。4.绵马贯众素可降低金葡菌在导管表面的粘附和纤维蛋白类生物基质的形成。5.绵马贯众素对金葡菌感染小鼠肾脓肿模型有治疗作用。6.绵马贯众素可通过抑制vWbp活性,降低金葡菌毒力。