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猪圆环病毒2型(PCV2)与猪群中发生的多种疾病相关,包括断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)、猪皮炎肾病综合征(PDNS)、先天性震颤(CT)等,已经给全世界养猪业带来了很大的经济损失。ORF2基因是PCV2的重要抗原基因,编码病毒的衣壳蛋白(Cap蛋白),PCV2的Cap蛋白基因(ORF2)包含有重要的抗原表位,是编码区别PCV1和PCV2的主要特异性蛋白的重要区域,并且编码蛋白具有良好的抗原性。本研究利用PCR技术扩增出PCV2 Cap蛋白的全基因片段,并进行了基因突变、克隆、重组构建,成功实现了Cap蛋白基因在腺病毒中的表达,并对表达蛋白进行了鉴定。
根据Genbank公布的PCV2 ORF2基因序列设计两对引物P1/P2和A/B,其中在引物P1/P2中分别加入ClaⅠ和XbaⅠ酶切位点,通过PCR技术从PCV2细胞株中扩增得到大小约为718bp的PCR产物。进而通过引物P1/A和引物B/P2分别扩增得到大小约为380bp和338bp的PCR产物ORF2a和ORF2b。通过重叠延伸PCR(SOE-PCR)技术在合适的退火温度下利用引物P1/P2和互为引物的片段ORF2a和ORF2b进行扩增,最终得到大小约为718bp的PCR产物,在本文中命名为mORF2。该定点突变的目的在于改造ORF2基因中间372-377bp处的XbaⅠ酶切位点,从而方便后面的片段在ClaⅠ和XbaⅠ酶的作用下完整的插入到克隆和表达载体中。
将上述扩增得到的mORF2经纯化后与克隆载体pMD18-T Simple连接,连接产物转化DH5a,然后在氨苄抗性(Amp+)平板上挑取阳性菌落,37℃过夜培养。提取质粒经双酶切鉴定,结果扩增片段与预期片段大小相符,DNA测序分析结果表明,基因片段完全正确。将鉴定正确的重组质粒pMD18-T-mORF2与表达载体pAD5-blue同时用ClaⅠ和XbaⅠ酶进行双酶切,分别经回收后连接。连接产物转化DH5a,然后在卡那霉素抗性(Kan+)平板上挑取阳性菌落,37℃过夜培养。经菌液PCR鉴定,结果所扩增的片段与预期片段大小相符;DNA序列分析结果表明,所插入的基因片段阅读框完全正确。然后利用PacⅠ对重组质粒进行酶切鉴定,结果与预计的相符,阳性重组质粒命名为pAd5-mORF2。经鉴定后,无内毒素质粒抽提试剂盒大量提取重组质粒,纯化后用PacⅠ酶切线性化,阳离子脂质体法转染到AD-293细胞,于37℃培养7天后出现细胞病变,收获病毒。经PCR检测,目的基因存在于重组腺病毒中且都在转录水平得到表达,并测得重组腺病毒原液的溶度为108.71 TCID50/ml。将从细胞上获得的重组腺病毒rAd-mORF2进行进行免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA),SDS-PAGE电泳和Western-blot分析,结果表明重组腺病毒中的蛋白基因能够在AD-293细胞中转录和表达重组腺病毒Cap蛋白基因,蛋白大小约为29kD。表达的Cap蛋白可与抗PCV2抗体发生特异性免疫反应,表明表达产物初步具有免疫反应活性。
将15只18-22g的雌性昆明小鼠随机分为3组,每组5只。第1组肌肉注射免疫PCV2 rAd-mORF2重组腺病毒,第2,3组免疫空载体腺病毒和PBS作为阴性对照和空白对照。首免后间隔14d加强免疫一次,共免疫两次。于5周尾静脉取血,通过ELISA进行中和抗体的检测,结果表明昆明小鼠体内有相应抗体产生。
综上所述,本研究成功构建了PCV2 rAd-mORF2重组腺病毒,且在AD-293细胞中能够表达PCV2的Cap蛋白。小鼠免疫试验证实,转染细胞后表达的蛋白具有一定的免疫原性,这为PCV2新型疫苗的研究奠定了基础。