无论是根尖周炎、牙周炎等炎症所导致的小范围牙槽骨缺损,还是创伤、肿瘤等导致的大范围颌骨缺损,会严重危害患者的口腔功能,并对患者的心理健康造成不良影响。常规手术治疗,不但过程复杂、耗时较长,还常难以获得理想的修复效果,因此促进内源性颌骨再生修复是治疗颌骨缺损的潜在策略。骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSC）能够通过自我更新及多向分化,在骨组织再生修复调控中发挥重要作用。与长骨来源的BMMSC相比,颌骨骨髓间充质干细胞（jaw bone marrow mesenchymal stem cells,JBMMSC）颌骨原位成骨的能力更强,是颌骨再生修复领域最具潜力的种子细胞。因此,提高JBMMSC增殖、分化等再生能力是促进内源性颌骨再生修复的关键。组织蛋白酶K（cathepsin K,CTSK）作为骨代谢的关键调控靶点,不仅表达于破骨细胞,在成骨细胞、骨细胞及间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSC）等骨形成相关细胞中均有表达。并有文献报道CTSK阳性骨膜干细胞参与骨折的再生修复过程,但内源性CTSK能否调控MSC的再生能力及其调控机制尚不十分清楚,亦未见CTSK调控牙槽骨再生修复的研究报道。拔牙窝的愈合过程与颌骨再生的过程基本相似,均为膜内成骨。因此,本课题拟以小鼠拔牙窝愈合为模型,利用Ctsk基因敲除小鼠首先明确CTSK在牙槽骨再生愈合过程中的作用;进而揭示Ctsk基因敲除或抑制对JBMMSC增殖及成骨分化等再生能力的调控作用;最后,探索其潜在的分子机制,以期为通过抑制CTSK促进JBMMSC的再生用于颌骨缺损的再生修复提供新的实验依据。第一部分CTSK在牙槽骨再生修复过程中的作用研究目的:通过拔牙窝愈合模型探索CTSK在牙槽骨再生修复过程中的作用。方法:首先构建C57BL/6 Ctsk基因敲除小鼠,通过琼脂糖电泳区分小鼠基因型,然后通过大体观察、Micro-CT扫描及免疫组化染色三个方面对基因敲除情况进行鉴定;随后选择8周龄Ctsk+/+和Ctsk-/-两种基因型小鼠,拔除双侧上颌第一磨牙,于术后第3、7、10、14、21和28天分别处死各组小鼠3只;然后通过体视显微镜、Micro-CT扫描、HE染色及Masson染色观察Ctsk基因敲除对拔牙窝愈合的影响;通过TRAP染色观察Ctsk基因敲除对拔牙窝愈合过程中破骨细胞的影响;最后通过Osterix免疫组化染色观察Ctsk基因敲除对拔牙窝愈合过程中成骨细胞的影响。结果:大体观察、Micro-CT扫描及免疫组化染色结果表明Ctsk基因敲除小鼠构建成功;体视显微镜结果显示:Ctsk基因敲除并不影响拔牙窝黏膜软组织的愈合;Micro-CT扫描、HE染色及Masson染色结果显示:正常小鼠拔牙窝愈合过程分为两个阶段:以骨质充填为主的骨充填阶段和以骨质改建重塑为主的骨重塑阶段。Ctsk-/-小鼠拔牙术后第10天时新生骨质即充填满拔牙窝,而Ctsk+/+小鼠则在拔牙术后第14天才充填满拔牙窝;TRAP染色结果显示:Ctsk基因敲除之后骨充填阶段拔牙窝内的破骨细胞数目无显著变化,而在骨重塑阶段破骨细胞数目增加;免疫组化染色结果显示:随着骨形成的增加,成骨细胞数目逐渐增多,当新生骨质充满拔牙窝之后成骨细胞数目开始逐渐降低。两组对比发现:拔牙术后7天时Ctsk-/-组小鼠拔牙窝内Osterix阳性细胞的数目高于Ctsk+/+组小鼠（P＜0.05）,随后Ctsk-/-组小鼠拔牙窝内Osterix阳性细胞的数目则低于Ctsk+/+组小鼠（P＜0.05）。结论:Ctsk基因敲除能够显著促进拔牙窝骨质愈合,且这种骨质愈合能力的增强可能与成骨能力的增强有关。第二部分CTSK在牙槽骨再生修复过程中的表达及分布研究目的:明确CTSK在牙槽骨再生修复过程中的表达及分布情况。方法:选择8周龄Ctsk+/+小鼠,拔除双侧上颌第一磨牙,拔牙术后3、7、10、14、21和28天分别处死小鼠3只,然后通过免疫组化染色观察拔牙窝愈合过程中CTSK的表达分布情况;通过TRAP染色观察拔牙窝愈合过程中破骨细胞的分布情况;最后通过免疫荧光共染观察拔牙窝愈合过程中是否存在CTSK+CD44+、CTSK+CD90+及CTSK+OSX+的细胞。结果:从时间分布上看,拔牙术后第3天拔牙窝内即可见CTSK+细胞,随后CTSK+细胞逐渐增加,第10天达峰值后逐渐降低;而破骨细胞则于拔牙后第7天才开始出现,随后其数目逐渐增加,第21天达峰值后逐渐降低。从空间分布上看,拔牙窝愈合过程中CTSK不仅表达于破骨细胞,还表达于CD44+/CD90+细胞及成骨细胞等多种细胞。结论:在拔牙窝愈合过程中,CTSK表达于多种细胞,从而提示在牙槽骨再生过程中CTSK不仅通过破骨细胞细胞介导的骨质吸收发挥作用,亦有可能通过CD44+/CD90+间充质干细胞及成骨细胞介导的骨质形成发挥作用。第三部分Ctsk基因敲除或抑制调控JBMMSC的增殖及成骨分化的作用及机制研究目的:探索Ctsk基因缺失或抑制对JBMMSC增殖及成骨分化能力的影响和潜在分子机制。方法:选择6周龄Ctsk+/+及Ctsk-/-小鼠,分离双侧下颌骨,利用组织块法分离培养JBMMSC。通过Western blot及免疫荧光染色检测CTSK在JBMMSC中的表达及定位;利用CCK-8、Western blot及茜素红染色检测Ctsk基因敲除或抑制对JBMMSC增殖及成骨分化能力的影响;通过转录组测序检测Ctsk+/+及Ctsk-/-小鼠来源JBMMSC的差异表达基因,并通过生物信息学分析揭示CTSK调控JBMMSC再生能力的可能机制;通过ECAR、葡萄糖消耗及乳酸分泌实验检测Ctsk基因敲除或抑制对JBMMSC糖酵解能力的影响;最后检测糖酵解抑制剂3PO能否阻断Ctsk基因敲除或抑制对JBMMSC增殖及成骨分化能力的调控作用。结果:JBMMSC中表达CTSK,且CTSK不仅分布在溶酶体,在细胞质中亦有分布。Ctsk基因敲除或抑制后JBMMSC增殖能力显著增强（P＜0.05）,成骨相关蛋白Runx2及ALP的表达水平显著增加（P＜0.05）,钙结节的数目及面积也显著增多（P＜0.05）;RNA-seq结果显示Ctsk-/-小鼠来源JBMMSC中糖酵解相关基因Pfkfb3、HK1等均显著升高;ECAR结果显示Ctsk基因敲除或抑制后JBMMSC的糖酵解及糖酵解能力均显著高于对照组（P＜0.01）,同时葡萄糖消耗及乳酸分泌均显著高于对照组（P＜0.05）;3PO阻断糖酵解之后,Ctsk基因敲除或抑制促进JBMMSC的增殖及成骨分化能力均减弱（P＜0.05）。结论:Ctsk基因敲除或抑制能够通过糖酵解途径促进JBMMSC的增殖及成骨分化。综上所述,本研究以小鼠拔牙窝愈合为模型,在动物体内证实Ctsk基因敲除可以促进牙槽骨再生修复,并指出CTSK在此过程中的作用可能不仅依赖于破骨细胞,亦有可能通过间充质干细胞及成骨细胞介导的骨质形成发挥作用;继而通过体外研究证实Ctsk基因敲除或抑制能够通过糖酵解途径增强JBMMSC的增殖及成骨分化等再生能力。但本研究仍存在一定的不足之处,需要进一步实验来完善,如构建BMMSC特异性Ctsk基因敲除小鼠以排除破骨细胞的影响;需体内实验验证3PO能否阻断Ctsk敲除小鼠牙槽窝的加速愈合。