随着生活水平的提升，糖尿病作为一种富贵病，其发病率日益上升，我国糖尿病患者人数已跃居世界首位。长期处于高血糖状态的糖尿病患者容易出现一系列微血管病变，由此导致的糖尿病并发症是影响糖尿病患者健康的主要问题。糖尿病视网膜病(Diabetic retinopathy，DR)是糖尿病最主要也是最常见的微血管并发症之一。根据糖尿病视网膜病的进程，主要分成早期阶段即非增殖性糖尿病视网膜病(Non-proliferative diabetic retinopathy，NPDR)和晚期阶段即增殖性糖尿病视网膜病(Proliferative diabetic retinopathy，PDR)，其中针对DR发病早期的NPDR进行治疗，比较容易控制DR的进一步发展。中药是祖国医学的瑰宝，从中寻找发现具有优良药效活性的候选活性化合物，已经成为药物研发的主要手段和研究策略。　　目的:　　本论文主要通过体内动物和体外细胞实验，观察高良姜素(Galangin)对NPDR的改善作用，进一步以逆转视网膜炎性损伤以及减弱血-视网膜屏障(Blood-retinal barrier，BRB)的破损为切入点，揭示高良姜素缓解NPDR的机制。通过本课题的研究为高良姜素在治疗糖尿病主要的并发症糖尿病视网膜病中的潜在应用提供一定的实验依据。　　方法:　　1.Ⅰ型糖尿病动物模型采用链脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)诱导，在糖尿病基础上进一步诱发早期糖尿病视网膜病即非增殖性糖尿病视网膜病(NPDR)实验动物模型，并给予药物Galangin进行干预。　　2.通过检测视网膜组织中伊文思蓝(Evans blue)渗漏的含量来评价实验动物血-视网膜屏障(BRB)的破损情况。　　3.视网膜组织中炎性因子和紧密连接蛋白基因的表达采用实时荧光定量PCR(Real-time polymerase chain reaction，Real-time PCR)实验检测。　　4.视网膜组织中炎性相关信号通路的激活、紧密连接蛋白的表达采用Western-blot实验检测。　　5.炎性细胞因子在动物血清、玻璃体腔、细胞上清中的含量采用酶联免疫吸附检测(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)实验检测。　　6.采用小胶质细胞特异性蛋白Iba-1(Ionized calcium binding adapter molecule1)免疫荧光染色实验检测神经小胶质细胞的激活。　　7.神经小胶质细胞BV-2同人视网膜血管内皮细胞(Human retinal endothelialcells，HREC)或人视网膜色素上皮细胞(Retinal pigment epithelium cells，RPEcells)共同孵育培养，并加入高浓度葡萄糖(High-glucose，HG)(25 mM)和不同浓度的Galangin(20，50μM)。分别采用跨内皮/上皮电阻检测实验以及异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothiocyanate isomer，FITC)标记葡聚糖的渗漏实验检测由HREC构成内屏障或RPE细胞构成外屏障的屏障破损情况。　　8.神经小胶质细胞BV-2与Galangin(20，50μM)以及HG(25 mM)孵育不同时间。采用Western-blot，Real-time PCR，活性氧(Reactive oxygen species，ROS)形成实验检测Galangin对HG诱导炎性损伤相关核因子κB(Nuclear factorkappa B，NFκB)信号通路的激活及其下游炎性因子蛋白和基因表达，以及对HG诱导细胞氧应激损伤的影响。　　9.神经小胶质细胞BV-2与Galangin(20，50μM)以及HG(25 mM)孵育不同时间。采用Western-blot检测Galangin对细胞外调节蛋白激酶(Extracellularregulated protein kinase1/2，ERK1/2)和p38激酶磷酸化激活的影响。　　10.神经小胶质细胞BV-2与ERK1/2抑制剂U0126(20μM)以及HG(25 mM)孵育不同时间。采用Western-blot，Real-time PCR检测ERK1/2抑制剂对HG诱导NFκB入核激活以及下游炎性因子表达的影响;采用活性氧ROS形成实验检测ERK1/2抑制剂对HG诱导细胞氧应激损伤的影响。　　11.神经小胶质细胞BV-2与抗氧化剂氮乙酰半胱氨酸(N-Acetylcysteine，NAC)以及HG(25 mM)孵育不同时间。采用Western-blot检测NAC对HG诱导NFκB入核的影响。　　12.HREC或RPE细胞培养于transwell小室中，小室下加入肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factor-α，TNFα)(20 ng/mL)和不同浓度的Galangin(20，50μM)。采用跨内皮/上皮电阻检测实验以及FITC标记葡聚糖的渗漏实验检测内屏障或外屏障的屏障破损情况。　　13.HREC或RPE细胞先与Galangin(20，50μM)预孵后，再加入TNFα(20ng/mL)，采用Western-blot实验检测紧密连接蛋白的表达。　　结果:　　1.STZ诱导的2月龄、3月龄小鼠NPDR实验模型中，体重以及血糖的结果显示Galangin(1，10 mg/kg)对于糖尿病小鼠体重减少的逆转并不明显，同时对糖尿病小鼠升高的血糖值也并无明显影响。　　2.Evans blue渗漏检测实验显示，不论2月龄或3月龄NPDR实验动物，Galangin(1，10 mg/kg)均能够明显减少NPDR小鼠视网膜中Evans blue的渗漏量。　　3.2月龄NPDR模型小鼠视网膜组织中NFκB的p65亚单位(NFκBp65)，核因子κB抑制蛋白α(NFκB inhibitorα，IκBα)，IKK(IκB kinase)的磷酸化水平均增加;同时NFκBp65和早期生长反应核因子-1(Early growth response-1，Egr1)的核转位水平也增加，而Galangin(10 mg/kg)可以降低NPDR小鼠视网膜中升高的NFκBp65，IκBα，IKK磷酸化水平;减少视网膜中增加的NFκBp65和Egr1的核转位激活;同时Galangin还能逆转NFκBp65和Egr1调控的下游细胞因子如TNFα、白细胞介素1β(Interleukin-1β，IL-1β)、白细胞介素6(Interleukin-6，IL-6)、组织因子(Tissue Factor，TF)、纤溶酶原激活物抑制剂-1(Plasminogen activator inhibitor type-1，PAI-1/Serpine1)在NPDR小鼠血清和视网膜组织中表达的升高。　　4.2月龄和3月龄NPDR模型小鼠视网膜组织中紧密连接蛋白Occludin和Claudin1的基因、蛋白表达水平均下降，而Galangin(1，10 mg/kg)腹腔注射给药可以逆转这一变化。同时2月龄NPDR模型动物，口服给予Galangin(10，30，100 mg/kg)亦能逆转这两个紧密连接蛋白表达的减少。　　5.2月龄以及3月龄NPDR模型小鼠视网膜组织中Iba-1的蛋白表达升高，视网膜免疫荧光染色的结果进一步证实了Iba-1表达的增加，而Galangin腹腔注射给药以及口服给药均可以明显抑制视网膜中Iba-1表达的增加。　　6.BV-2细胞同HREC或RPE细胞共同培养的实验发现，HG(25 mM)可以导致HREC或RPE细胞所形成单细胞层的跨细胞电阻值降低，同时FITC标记葡聚糖渗漏通过HREC或RPE所形成单细胞层的量增加，说明BV-2细胞与HREC或RPE细胞共同培养状态下，HG会对HREC或RPE细胞构成的内屏障或外屏障起到了损伤作用。而Galangin(20，50μM)可以逆转这种情况下降低的电阻值以及增加的FITC标记葡聚糖渗漏。　　7.体外BV-2细胞上，Galangin(20，50μM)能够抑制HG诱导的BV-2细胞内NFκB炎性信号通路的激活，包括降低升高的NFκBp65、IκBα、IKK磷酸化水平，抑制NFκBp65的核转位激活以及下游炎性因子的表达;Galangin还能够抑制HG诱导的BV-2细胞内Egr1的核转位激活。进一步研究发现Galangin还可以缓解HG诱导BV-2细胞的氧应激损伤。　　8.体外BV-2细胞上发现Galangin(20，50μM)可以降低HG诱导的细胞内ERK1/2的磷酸化激活，对p38激酶的磷酸化则没有明显影响。体内实验同样发现2月龄NPDR模型小鼠视网膜组织内ERK1/2的磷酸化水平增高，而Galangin(1，10 mg/kg)能降低升高的ERK1/2磷酸化水平。　　9.细胞中ROS分析实验发现ERK1/2抑制剂U0126可降低由于HG所导致的BV-2细胞中ROS水平的增加;并减少HG诱导的细胞内转录因子NFκBp65的核转位激活以及下游炎性因子表达的升高。　　10.抗氧化剂NAC可以抑制HG诱导的BV-2细胞中转录因子NFκBp65的核转位激活。　　11.TNFα直接刺激HREC或RPE细胞的实验发现，TNFα诱导了两种细胞所形成单细胞层的跨细胞电阻值降低，并增加了FITC标记葡聚糖渗漏通过HREC或RPE所形成单细胞层的量，而Galangin(20，50μM)同样可以逆转由TNFα刺激所导致的电阻值降低以及FITC标记葡聚糖渗漏的增加。　　12.TNFα降低了HREC或RPE细胞中紧密连接蛋白Claudin1和Occludin的表达，而Galangin(20，50μM)可以逆转TNFα降低的这两种紧密连接蛋白的表达。　　结论:　　1.Galangin腹腔注射、口服灌胃给药均可以明显改善NPDR，这种作用可能与其抑制视网膜炎性损伤，缓解BRB损伤相关。　　2.深入研究Galangin改善NPDR的机制，发现Galangin可以抑制由高糖所诱导的小胶质细胞活化，抑制了小胶质细胞中ERK1/2-ROS-NFκB信号通路的激活，减少了NFκB介导的下游TNFα等促炎因子的释放，缓解了NPDR进程中视网膜的炎性损伤;并进一步逆转了促炎因子TNFα所造成的视网膜血管内皮和视网膜色素上皮细胞中紧密连接蛋白如Claudin1和Occludin表达的减少，从而改善了BRB（包括HREC组成的内屏障和RPE细胞组成的外屏障）的破损，最终发挥了改善NPDR的药效活性。