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单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes,LM）是一种人畜共患食源性致病菌,能够耐受高盐、低温、营养贫瘠等环境。因此,食品在生产中极易受到LM的污染。危险罗尔斯通氏菌（Ralstonia insidiosa,RI）广泛存在于水环境中,能够很好地适应低营养条件,并产生聚集。实验室前期研究表明,LM在RI菌液或其无菌上清液的存在下,可以形成悬浮聚集体。本课题首先研究环境因素对LM悬浮聚集体形成的影响,利用实验室前期的转录组数据作为切入点,通过生物信息学分析统计差异表达基因,并根据基因功能注释和文献挖掘RI菌液或其无菌上清液促进LM形成悬浮聚集体的关键基因。通过构建目的基因的缺失株和回补株,研究该调控基因对于LM形成悬浮聚集体的调控作用。后期利用代谢组技术,分析不同营养浓度下培养得到的RI无菌上清液的关键代谢物,以便进一步验证关键代谢物在诱导LM悬浮聚集体形成过程中发挥的作用。本研究可以从基因水平和代谢水平上初步解析这些基因或成分对LM形成悬浮聚集体的影响程度和作用机制,为进一步探索食源性致病菌在食品加工环境中残留的原因提供参考,同时能够了解RI诱导LM形成悬浮聚集体的初步作用机制,以期为LM耐受不良环境的原因与食源性致病菌的控制提供理论支撑。具体的实验结果见下方:（1）环境因素对RI诱导LM形成悬浮聚集体的影响:本文研究了不同营养浓度、温度、转速、培养时间、盐浓度以及p H等因素对RI诱导LM形成悬浮聚集体的影响。结果表明:LM单独培养时不形成悬浮聚集体;而在RI的作用下,LM在1/5 TSB营养状态下于28℃和40 r/min培养24 h后的悬浮聚集体的形成程度最高。扫描电子显微镜的观察结果表明:在RI的作用下LM被诱导聚集,产生了较多的胞外多聚物。而且,高浓度的Na Cl和酸性环境不利于悬浮聚集体的形成。（2）悬浮聚集体的转录组分析和LM关键基因的敲除与回补:以实验室前期对LM悬浮聚集体的转录组测序为基础,进行转录组分析,结合与生物膜形成的相关文献,筛选得到可能与悬浮聚集体形成相关的差异基因（fli M、che A、che Y、mot A）,这些基因与LM鞭毛组装和细菌趋化性相关。基于同源重组技术,利用温敏型质粒p MAD和整合型质粒p IMK2在LM菌株中构建出基因缺失株和回补株。基因缺失株和回补株生长曲线的结果表明,fli M、che AY（同时敲除che A和che Y）和mot A的缺失和回补未影响其正常生长,可以用于其他的实验研究。LM的基因che AY和mot A可能与关键代谢物存在相互联系。有两种可能的作用方式:关键代谢物使che AY或mot A的表达量增加;关键代谢物与che AY或mot A片段上的阻遏物结合,促进che AY或mot A表达。（3）基因缺失株和回补株的趋化性及其悬浮聚集体的形成能力:在RI及其无菌上清液的诱导作用下,研究了基因缺失株（LM△fli M、LM△che AY和LM△mot A）和基因回补株（LM△fli M-p IMK2-fli M、LM△che AY-p IMK2-che AY和LM△mot A-p IMK2-mot A）的趋化能力和形成悬浮聚集体的能力。结果表明:fli M、che AY和mot A基因编码的蛋白在LM趋化中起决定性作用,fli M、che AY和mot A的缺失未影响LM被RI诱导形成悬浮聚集体的能力,但che AY和mot A的缺失使LM几乎不能被RI无菌上清液诱导形成悬浮聚集体,可能是RI诱导LM形成悬浮聚集体途径不止一种,因为RI无菌上清液中的代谢物种类少于RI菌液,而且RI菌株在生长过程中能够持续产生代谢物,以供LM使用。（4）RI无菌上清液的关键成分分析:利用不同营养浓度肉汤（TSB、1/2 TSB、1/5 TSB、1/10 TSB）培养得到RI无菌上清液,发现1/5 TSB和1/10 TSB培养的RI无菌上清液可以诱导LM形成悬浮聚集体,1/2 TSB营养状态下有少量悬浮聚集体形成,但效果不明显,而TSB培养的RI无菌上清液无法诱导LM形成悬浮聚集体。通过温度（60℃、80℃、100℃、121℃）处理不同营养浓度肉汤（TSB、1/5 TSB、1/10 TSB）培养的RI无菌上清液,发现60℃及以上的处理使TSB肉汤培养的RI无菌上清液获得诱导LM形成悬浮聚集体的能力。同时,在80℃、100℃和121℃处理之后,1/5 TSB和1/10 TSB培养的RI无菌上清液的诱导能力分别是对照组的2.5倍和1.5倍。采用非靶向和广泛靶向代谢组学技术,以TSB肉汤培养的RI无菌上清液为对照,对1/5 TSB肉汤培养的RI无菌上清液和1/10 TSB肉汤培养的RI无菌上清液的关键代谢物进行差异分析。发现在营养贫乏的环境下,RI的氨基酸合成与代谢效率降低。将两组差异代谢物进行相似代谢物的筛选,发现31种成分可能是关键代谢物,氨基酸及其代谢物占比最大,然后是酚类成分和有机酸及其衍生物。