小肠中存在大量肠道菌群,而上皮层则是位于宿主和肠道菌群之间的重要物理屏障。其中,肠道上皮细胞由位于肠腔一侧的一层单细胞层组成,这群细胞面对着寄居在肠道中数以亿计的共生菌群。肠道上皮淋巴细胞(IEL)则是定位于肠道上皮组织细胞之间的淋巴细胞,它参与抵御病原体的保护性免疫反应,并帮助机体维持对共生菌的耐受,在维持肠道组织稳态的过程中发挥了重要作用。这群位于前线部位的IEL几乎全部由T细胞组成,并且以CD8+ T细胞为主。根据其T细胞受体以及共受体表达的差异,可以将IEL分为两大类:A型IEL和B型IEL。其中,A型IEL是一群经过抗原活化的细胞毒T细胞,主要由CD8αβ+IELs组成,它们在定位到肠道上皮之前,预先在派氏结或肠系膜淋巴结经过了抗原的活化,同时,这群CD8αβ+IELs具有很强的细胞毒效应,并且其数量会随着年龄增长而逐渐增多。这群IEL在肠道上皮中面临更多的是肠道中的共生菌群,而不是入侵的病原菌,由此我们提出了两个问题:CD8αβ+IELs针对肠道共生菌群会有怎样的效应功能?CD8αβ+IELs在面对肠道共生菌时是否会发挥除了细胞毒效应之外的功能?这群CD8αβ+ IELs和肠道共生菌之间的功能关系目前还不明确,我们针对这些问题展开了以下研究。目前取得的主要工作结果包括四个部分:1.共生菌可以调控CD8αβ+ IELs在小肠上皮的累积为了进一步探讨CD8αβ+IELs和肠道共生菌之间的作用,我们首先关注了它们之间的正向调控关系。实验发现,在无菌小鼠和抗生素水处理后的小鼠中,肠道上皮CD8αβ+IELs的数量和比例显著低于对照组小鼠,说明肠道共生菌能调控CD8αβ+IELs在肠道上皮中的数量。进一步比较抗生素水饲喂以及正常水饲喂小鼠的肠道微生物DNA总量后,我们发现在抗生素处理后的小鼠中,肠道菌群总载量出现了大幅降低,这进一步提示了肠道上皮CD8αβ+IELs的数量和肠道菌群的载量正相关。同时,抗生素水处理组小鼠中肠道菌群的组成也发生了明显变化,其中最突出的变化是放线菌门和拟杆菌门的细菌大幅减少。抗生素单独处理的模型也提示了,肠道中影响CD8α3+IELs数量的是一群氨苄青霉素敏感的细菌。为了进一步探究在抗生素处理过程中被大量清除的拟杆菌门和放线菌门是否可以诱导CD8αβ+IELs,我们选择了拟杆菌门中的益生菌——双歧杆菌来进行菌种移植的实验。在抗生素的初步处理后,小鼠肠道中原有的双歧杆菌被完全清除。之后,我们对小鼠进行了双歧杆菌的灌胃处理,灌胃9天后对小鼠粪便样本进行定量PCR检测,结果显示小鼠肠道中成功植入了双歧杆菌。植入双歧杆菌15天后,肠道上皮中CD8αβ+IELs数量明显增多,证明肠道中一些特定的共生菌(如双歧杆菌)可以诱导CD8αβ+IELs的产生。2.共生菌依赖的CD8αβ+ IELs在肠道上皮的聚集需要Toll样受体信号Toll样受体(TLR)在肠道巨噬细胞、树突状细胞和肠道上皮细胞中有广泛的表达,并且可以识别多种共生和病原相关分子模式,因此我们关注了 TLR信号在调控A型IEL方面的作用。我们在多种TLR缺陷鼠(包括TLR2缺陷鼠,TLR4缺陷鼠,TLR9缺陷鼠及其联合缺陷鼠)中均发现了 CD8αβ+ IELs的数量减少,这一现象和抗生素处理组小鼠一致,这一结果说明肠道共生菌通过TLR信号影响了 CD8αβ+IELs在肠道上皮中的数量,此外,CD8αβ+IELs上本身并没有TLR的表达,因此TLR信号对CD8αβ+ IELs的调控作用是间接的。3.CD8αβ+IELs具有潜在的杀菌活性我们已经证明了共生菌对CD8αβ+ IELs在肠道上皮中的数量维持十分重要,我们下一步想到的是:CD8αβ+IELs是一群具有细胞毒效应的T细胞,为什么它们的数量会和肠道共生菌存在这样的正相关性?在稳态状况下,这群CD8αβ+IELs在细胞毒效应之外,是否具有一些和肠道共生菌相关的其他功能?为了进一步对这些问题进行研究,我们通过基因芯片分析对比了 CD8αβ+IELs和脾脏中的CD8αβ+脾脏淋巴细胞(CD8αβ+SPLs)。基因芯片的结果显示,在没有经过任何体外刺激的情况下,CD8αβ+IELs中一系列和抗菌过程相关的基因均出现上调表达,且上调倍数在20倍以上,这些基因包括Defal,RegⅢγ,lpd8。而在CD8αβ+IELs中上调表达的基因里,上调表达最明显的是α-防御素家族的基因,其中包括mmβ7,它所编码的基质金属蛋白酶MMP7可以将无活性的α-防御素前体加工为成熟的活化形式。我们进一步通过RT-PCR,流式细胞术和免疫荧光实验证明了 CD8αβ+IELs在基因和蛋白水平都能表达α-防御素。此外,在无菌小鼠和抗生素处理组小鼠中,defensin 1+CD8αβ+IELs的数量都显著低于对照组中未处理的SPF级小鼠,这进一步证明了 defensin l+CD8αβ+IELs的存在也依赖肠道共生菌。综上,我们证明了 CD8αβ+IELs能够产生抗菌肽并且这群能产生抗菌肽的CD8α+IELs数量与肠道共生菌正相关。4.CD8αβ+ IELs的分泌产物能抑制细菌的生长防御素是一种广谱的抗菌肽并且针对多种细菌都有抗菌作用,因此,在确认了 CD8αβ+IELs中α-防御素的表达之后,我们通过体外实验进一步研究了 CD8αβ+IELs的抗菌活性。我们分选出CD8αβ+ IELs和CD8αβ+ SPLs并在体外分别培养24小时,在培养的最后6小时中加入PMA和离子霉素进行刺激,并收取细胞培养上清进行抗菌活性的检测。在抗菌实验中,添加了 CD8αβ+IELs刺激培养上清的牛津杯周围形成了清晰的抑菌环,说明CD8αβ+IELs的分泌产物可以抑制细菌生长,这一抑菌活性很可能来自于CD8αβ+IELs分泌的防御素等抗菌肽。此外,IL-15刺激后CD8αβ+ IELs的培养上清周围同样出现了抑菌环,且抑菌环直径显著大于未刺激组,进一步提示IL-15可以促进CD8αβ+IELs的抑菌活性。总结:综上所述,作为肠道上皮淋巴细胞中的重要组成部分,CD8αβ+IELs和肠道共生菌密切相关,而CD8αβ+IELs在细胞毒作用之外的功能尚不明确,其在稳态过程中的作用也值得进一步探究。在我们的研究中,首先确认了肠道共生菌能够调控CD8αβ+IELs在肠道上皮中的数量,并且这一调控作用是通过TLR信号进行的。此外,我们证明了一些特定的共生菌能够诱导CD8αβ+IELs的增多。进一步的基因芯片分析发现,在这群共生菌依赖的CD8αβ+IELs中,一系列编码抗菌肽的基因都出现了上调表达,并且CD8αβ+IELs的分泌上清具有直接的抗菌活性,说明共生菌依赖的CD8αβ+IELs能够有效地抑制细菌生长。总之,我们的研究发现,CD8αβ+IELs受到肠道共生菌的调控,同时,其分泌产生的抗菌肽也能抑制细菌的生长,CD8αβ+IELs和肠道菌群的这一相互作用共同促进了肠道微环境的稳态。