【摘 要】
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背景:膝关节骨性关节炎(Osteoarthritis,OA)作为一种不可治愈的异质性疾病,导致运动障碍,并影响患者的日常生活和工作。尽管当今临床医学已经有各种治疗手段,但只能缓解症状不能根治。关节腔注射内源或外源性富血小板血浆(Platelet-rich plasma,PRP)是骨性关节炎的一种新型治疗手段,在骨科临床中已广泛证实其有效性,但尚未明确其修复关节软骨的机制。由于PRP的制备、保存等一
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背景:膝关节骨性关节炎(Osteoarthritis,OA)作为一种不可治愈的异质性疾病,导致运动障碍,并影响患者的日常生活和工作。尽管当今临床医学已经有各种治疗手段,但只能缓解症状不能根治。关节腔注射内源或外源性富血小板血浆(Platelet-rich plasma,PRP)是骨性关节炎的一种新型治疗手段,在骨科临床中已广泛证实其有效性,但尚未明确其修复关节软骨的机制。由于PRP的制备、保存等一系列操作未形成标准化规定,因此商业途径获得的PRP产品有着较大的成分和疗效差异。PRP成分的影响因素包括:血液供体、温度、p H值、制备方式、抗凝剂、取血因素等。从PRP制备的血液来看,不同的运动类型、时间和强度能改变血液的成分,也会进一步影响PRP的成分和功效。目的:本研究首先建立急性运动小鼠模型,探讨急性运动前后及不同恢复时间对小鼠PRP中代谢物的影响。其次,建立膝关节骨性关节炎小鼠模型,探讨大鼠急性运动后获得的PRP对小鼠膝关节骨性关节炎的疗效,并探讨关节软骨的修复机制,为采集外源性PRP治疗骨性关节炎提供科学依据。方法:购入实验所需雄性4周龄48只C57BL/6J小鼠、20只SD大鼠,饲养2周产生适应后随机分组,进行两批实验。第一批实验,24只小鼠随机分为4组,每组6只,(1)S组:安静对照组;(2)R0组:运动后即刻组,运动后立刻处死取材;(3)R60组:运动后一小时组,运动恢复1小时后处死取材;(4)R24组:运动后24小时组,运动恢复1天后处死取材。运动方式采用递增负荷跑台运动。第一批实验中小鼠眼球取血后,S、R0、R60、R24组小鼠血清制备PRP进行非靶标代谢组学测试,探究运动后不同休息时间后PRP代谢物的变化。第二批实验,20只大鼠作为PRP供体随机分为2组,每组10只:(1)DR组,运动干预PRP供体组;(2)DS组,安静对照PRP供体组。运动方式依然采用递增负荷跑台运动。DR组运动后即刻眼球取血,同时DS组安静状态下眼球取血,制备PRP,用于OA小鼠的骨性关节炎治疗。24只小鼠作为OA治疗受体随机分为4组,每组6只:(1)CON组:健康对照组;(2)KON组:碘乙酸造模对照组;(3)KS组:碘乙酸造模+注射安静PRP;(4)KR组:碘乙酸造模+注射运动PRP。造模和治疗均在小鼠后肢左右膝关节同时进行。进行4周PRP治疗后,CON、KON、KS、KR组用ELISA方法检测血清有关炎症因子,部分膝关节软骨进行切片染色观察软骨形态,部分膝关节软骨采用PCR和WES全自动蛋白印迹系统进行基因表达以及蛋白检测。结果:(1)非靶标代谢组学结果显示,运动后不同恢复时间PRP中的代谢产物不断发生变化。相比安静对照组,运动后即刻和恢复24小时后的差异显著(P<0.05),但恢复60分钟后PRP代谢物差异不具有统计学意义。其中,R0组对S组上调差异代谢物7个,下调13个,差异代谢通路涉及氨酰-t RNA生物合成、亚油酸代谢、氰基氨基酸代谢等;R24组对S组差异代谢物上调4个,下调40个,差异代谢通路涉及精氨酸和脯氨酸代谢、氨酰-t RNA生物合成、氰基氨基酸代谢以及甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢等。(2)形态学染色结果显示,造模组KON小鼠的软骨细胞形态相较于CON对照组发生明显的破坏,经PRP治疗后KS和KR两组软骨有显著修复,但KS和KR两组间软骨细胞形态学差距较小。(3)软骨发生相关的细胞因子ELISA检测显示,血清生长因子TGF-β在PRP治疗后显著升高(P<0.05),血清炎症因子NLRP3和TNF-α在治疗后也出现非常显著升高(P<0.01)。KS和KR两组之间无显著性差异(P>0.05)。(4)软骨发生相关的基因表达显示,PTEN、MMP2、Casp3、Bcl2、COMP、MMP9、ASPN、ANKH、Cstk等软骨增殖、凋亡和结构蛋白相关的基因表达水平在各组中都不具备显著性差异,且组内表达差异较高。(5)蛋白表达结果显示,软骨增殖负调控因子PTEN、正向调控因子p Akt/Akt、PTP1B等软骨发生相关蛋白的表达水平在各组中都不具备显著性差异,且组内表达差异较高。结论:(1)PRP代谢物成分因不同运动恢复时间产生变化。急性运动后即刻或恢复24小时后PRP代谢组变化显著,但恢复60分钟后代谢组水平无显著变化。提示:通过运动改良PRP制备时血液的采集时间点值得考虑。(2)与安静时采集血液制备的PRP相比,运动后即刻采集血液制备的PRP在OA治疗上并无显著优势,应进一步考察运动后其他恢复时间点的PRP采集是否更有疗效。(3)大鼠外源性的PRP对小鼠骨性关节炎有显著治疗作用,但并未表现出炎症减轻,以及软骨发生相关的基因与蛋白表达改变,表明外源性PRP治疗时关节软骨的修复与炎症水平、PTEN/Akt信号通路并不一一相关。
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