论文部分内容阅读
玉米赤霉烯酮（zearalenone,ZEA）,又称F-2毒素,是由镰刀菌和禾谷镰刀菌产生的一种非甾体类雌激素类真菌毒素,主要来源于田间、农场或储藏期间受到镰刀菌和赤霉菌污染的谷物和饲料。ZEA是一种霉菌雌激素,可以发挥雌激素样作用,从而对生殖系统造成损伤,使得ZEA受到越来越多的关注。桦木酸（betulinic acid,BA）是一种天然的羽扇豆烷型五环三萜类的抗氧化剂,前期研究发现BA通过抗氧化应激,有效地缓解了T-2毒素所致睾丸的氧化损伤。但BA对ZEA引起的睾丸组织氧化损伤是否具有保护作用?其机制如何?迄今未见报道。目的:本试验采用灌服ZEA诱导睾丸组织氧化损伤模型,研究BA对ZEA致小鼠睾丸氧化损伤的保护作用,为抵御睾丸氧化损伤,为雄性生殖系统健康探索新的途径。方法:将60只雄性KM小鼠随机分为6组,即对照组,BA（0.5 mg/kg）组,ZEA（20 mg/kg）组,ZEA与低、高剂量BA（0.25 mg/kg、0.5 mg/kg）联合组,ZEA+维生素E（100 mg/kg）联合组。ZEA溶于5%乙醇溶液中连续灌胃1 W,诱导睾丸损伤模型,随后将BA或维生素E混悬于1%的可溶性淀粉中连续灌胃2 W。（1）BA对ZEA致小鼠睾丸损伤的修复作用首先,观察睾丸的组织形态学变化,包括睾丸大体观察和脏器系数分析;H＆E染色观察睾丸组织的病理变化;Tunel法检测睾丸组织中细胞凋亡率。其次,检测睾丸的氧化还原系统,包括小鼠睾丸活性氧（reactive oxygen species,ROS）水平、丙二醛（malondialdehyde,MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）、过氧化氢酶（catalase,CAT）、谷胱甘肽（glutathione,GSH）和谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase,GHS-Px）水平。再次,检查雄性生殖系统,包括检测雌激素受体α（estrogen receptor alpha,ERα）的表达水平;血清睾酮（testosterone,T）水平;透射电子显微镜观察血睾屏障（blood testis barrier,BTB）超微结构;实时荧光定量PCR检测血睾屏障基础细胞外质特化主要蛋白N-钙粘蛋白（cadherin 2,CDH2）、紧密连接关键结构蛋白紧密连接蛋白11（claudin 11,CLDN11）和波形蛋白（vimentin,Vim）的基因表达;检测附睾组织中精子活力。最后,检测睾丸组织中炎症因子白细胞介素1β（interleukin-1 beta,IL-1β）、IL-6、IL-10和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）的基因表达。（2）BA调控MAPK和Nrf2信号通路缓解ZEA致小鼠睾丸损伤的机制Western blot检测丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）信号通路中p38、c-Jun N端激酶（c-Jun N-terminal kinase,JNK）和细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases 1/2,ERK1/2）蛋白表达及其磷酸化水平;Western blot检测核因子E2相关因子2（nuclear factor erythroid-2 related factor 2,Nrf2）信号通路中Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1（epoxy chloropropane Kelch sample related protein-1,Keap1）、Nrf2和血红素氧合酶1（heme oxygenase-1,HO-1）的蛋白表达;免疫组化检测Nrf2和HO-1含量和分布情况。结果:（1）BA能减轻ZEA致睾丸组织生精小管萎缩,管腔细胞脱落,管腔阻塞,血管扩张充血,细胞间质空泡化等病理变化并修复睾丸结构,降低细胞凋亡率;（2）BA能显著提高睾丸组织中SOD和CAT等抗氧化酶活性以及GSH的含量,极显著降低ZEA致小鼠睾丸中ROS和MDA水平的上升,说明BA通过提高机体抗氧化能力,缓解小鼠睾丸的氧化应激;（3）BA治疗后上调了ERα的表达水平,提高了血清T的水平,恢复了精子活力,上调了血睾屏障CDH2、CLDN11和Vim蛋白的表达来重建血睾屏障从而缓解ZEA致小鼠睾丸的损伤;（4）BA极显著的提高小鼠睾丸中抗炎因子IL-10 m RNA的水平,降低促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-αm RNA的水平;（5）BA能够抑制p38、ERK蛋白磷酸化并且激活Nrf2、HO-1的蛋白表达,说明BA是通过抑制MAPK信号通路激活Nrf2信号通路来修复ZEA诱导的小鼠睾丸氧化损伤。结论:BA通过提高小鼠睾丸组织的抗氧化能力,抑制炎症反应,上调ERα的表达,提高血清T的水平,重建血睾屏障,对ZEA引起的睾丸损伤具有治疗性保护作用。这种保护作用主要通过抑制MAPK信号通路,同时激活Nrf2信号通路进行调控。