【摘 要】
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红曲色素（Monascus pigments,MPs）是由红曲菌属的丝状真菌产生的主要次级代谢产物之一。MPs作为天然食用色素,在我国及东南亚地区已有上千年的应用历史,也是近年我国增长最快的天然食品着色剂。MPs属于聚酮化合物,由红曲菌基因组中的一个基因簇调控合成,有多个酶参与,其中聚酮合酶（Polyketide synthase,PKS）为关键酶。尽管早在1963年就开始了MPs生物合成途径的研
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红曲色素（Monascus pigments,MPs）是由红曲菌属的丝状真菌产生的主要次级代谢产物之一。MPs作为天然食用色素,在我国及东南亚地区已有上千年的应用历史,也是近年我国增长最快的天然食品着色剂。MPs属于聚酮化合物,由红曲菌基因组中的一个基因簇调控合成,有多个酶参与,其中聚酮合酶（Polyketide synthase,PKS）为关键酶。尽管早在1963年就开始了MPs生物合成途径的研究,但到目前为止,其具体合成途径仍存在争议。本研究首先对红色红曲菌（M.ruber）M7中MPs基因簇进行了染色体定位,并验证了MPs的pks（Mpig A）、Mpig O/N、Mpig D和Mpig C基因在转录水平是活跃的;然后将MPs基因簇中的pks基因在米曲霉（Aspergillus oryzae）中异源表达,分析了其代谢产物;进一步在米曲霉中异源共表达了pks基因与Mpig O/N基因,分析了其代谢产物,并推测了MPs的生物合成途径。主要研究结果如下:1.MPs基因簇的染色体定位与转录分析通过脉冲场凝胶电泳分析发现,红色红曲菌M7的基因组包括7条染色体（从大到小编号为I-VII）,并通过Southern杂交和PCR验证可知,M7的MPs合成基因簇位于第V条染色体上。进一步以M7的c DNA为模板,成功扩得到了MPs基因簇的pks、Mpig O/N、Mpig D和Mpig C基因,说明合成MPs的这些基因在M7中是活跃的。2.MPs的pks基因在米曲霉中的异源表达利用酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）同源重组机制将MPs的pks基因构建到入门质粒（p EYA）,并通过Gateway技术中的LR反应,成功将入门质粒上的pks基因置换到目的质粒（p TAYAGSarg3P）中,获得表达载体（p T3P-pks）。然后采用原生质体转化方法,将表达载体转化米曲霉M-2-3（受体菌）,得到了含有pks基因的米曲霉转化子A.oryzae-A。对米曲霉M-2-3和转化子A.oryzae-A的代谢产物进行了HPLC与LC-MS分析。结果表明,转化子A.oryzae-A主要产物为物质A（m/z=246）,其结构式还在鉴定中。在对物质A纯化的过程中发现了物质B（m/z=252）。物质B为pks基因在米曲霉中的预期表达产物,推测物质B可能被米曲霉中的氧化还原酶催化形成了物质A。3.pks基因与Mpig O/N基因在米曲霉中的共表达利用酿酒酵母同源重组机制,将MPs基因簇中Mpig O/N基因构建到上述已经构建的含有pks基因的质粒（p T3P-pks）中,得到共表达载体（p T3P-pks-1G）。采用原生质体转化方法,将共表达载体转化米曲霉M-2-3,得到了含有pks和Mpig O/N基因的米曲霉转化子（A.oryzae-A-ON）。对米曲霉M-2-3和转化子的代谢产物进行了HPLC与LC-MS分析。结果表明,与M-2-3相比较,转化子A.oryzae-A-ON产生了三种新化合物,分别为物质C、D和E。其中主要产物为物质D,分子量为232,物质C的分子量为250,其结构式还在鉴定中,而物质E与第三章中的物质A为同一化合物,分子量为246,结构式也还在鉴定中。
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