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目的:研究中药淫羊藿单体成分淫羊藿苷(ICA)对免疫抑制小鼠免疫和造血功能影响,进一步探讨其免疫学调节机制,为ICA作为一种免疫调节剂及化疗保护剂应用于临床提供理论和实验依据。
方法:
1将60只7-8周龄C57BL/6j小鼠随机分为6组,建立小鼠免疫抑制模型[1],其中实验组、阳性对照组和模型对照组均于腹腔注射环磷酰胺(Cy,300mg/kg)；第二天,实验组通过灌胃方式给予不同剂量ICA(150、80、40mg/kg.day),阳性对照组小鼠经腹腔注射参芪扶正注射液,(1ml/day,0.4mg/ml),模型对照组小鼠给予等量生理盐水(NS),连续给药10d,正常对照组小鼠不做任何处理,正常饲养。每天观察小鼠生存状态,于末次给药12小时后引颈处死小鼠,分离胸腺、脾、腹腔巨噬细胞、骨髓、外周血用于实验,称量胸腺和脾脏的重量,计算胸腺指数(TI)和脾脏指数(SI)。
2采用HE染色光镜下观察小鼠胸腺组织结构变化。
3采用MTT法检测小鼠脾淋巴细胞的增殖反应。
4采用乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测腹腔巨噬细胞、脾NK细胞、CTL细胞的杀伤能力。
5采用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测腹腔巨噬细胞产生TNF-α、IL-12和脾淋巴细胞产生TNF-α的水平。
6采用流式细胞术检测脾脏细胞中T细胞亚群的变化。
7采用瑞氏-姬姆萨染色观察骨髓和外周血细胞形态变化。
8采用全自动血细胞计数仪检测外周血血细胞计数的变化。
9光镜下计数小鼠单根股骨骨髓细胞的数量。
结果:
1成功建立了环磷酰胺诱导的小鼠免疫抑制模型[1],模型对照组小鼠活动能力差,进食饮水状况不佳,在第6天时有一只死亡；正常对照组、阳性对照组、实验组小鼠的活动、进食、饮水均正常活跃,全部存活。模型对照组小鼠脾脏指数和胸腺指数明显低于正常对照组,ICA各剂量均可使小鼠脾脏指数升高,与模型对照组相比有显著性差异。ICA高(150mg/kg·day)、低(40 mg/kg·day)剂量组提高了小鼠胸腺指数,与模型对照组相比有统计学意义,但均未达到正常组水平。
2模型对照组小鼠胸腺组织结构发生明显改变,胸腺周围出现脂肪细胞变性和坏死,低剂量(40mg/kg)ICA处理组小鼠胸腺组织仍可见部分脂肪组织填充,但未见明显坏死组织。参芪扶正注射液和中、高剂量ICA处理组小鼠胸腺组织形态正常,未见明显改变。
3 ConA可明显促进高(150mg/kg·day)、中剂量(80mg/kg·day)ICA处理组和参芪扶正注射液处理组小鼠脾脏T细胞增殖反应,与模型对照组相比,有显著性差异(P<0.05)；LPS可促进高剂量ICA组小鼠B细胞的增殖反应,与模型对照组相比有显著性差异(P<0.05),中、低剂量ICA处理后,对小鼠脾B细胞增殖反应无显著影响(P>0.05)。
4与正常对照组小鼠相比,模型对照组小鼠腹腔巨噬细胞、NK细胞和CTL细胞的杀伤活性显著降低(P<0.01),不同浓度ICA均能提高巨噬细胞、NK细胞和CTL细胞的杀伤活性,与模型对照组相比具有显著性差异(P<0.05)；高浓度ICA处理组和阳性对照组小鼠巨噬细胞、NK细胞和CTL细胞的杀伤活性与正常对照组相比,无明显差异(P>0.05)。
5与正常组小鼠相比,模型组小鼠腹腔巨噬细胞产生TNF-α、IL-12和脾细胞产生TNF-α的水平明显降低(P<0.01),经ICA处理10天后,实验组小鼠腹腔巨噬细胞产生TNF-α、IL-12和脾细胞产生TNF-α的水平与阳性对照组及正常对照组相比无显著性差异(P>0.05)。
6与正常组比较,模型对照组小鼠CD3+T细胞和NKT细胞比例明显降低。ICA灌胃治疗小鼠10天后,与模型对照组相比,小鼠脾淋巴细胞中CD3+T细胞和NKT(CD3+NK1.1)细胞百分比均显著升高(P<0.01),其中ICA高、低浓度组小鼠CD3+T细胞百分比高于正常对照组(P<0.01)。ICA高、中浓度组小鼠NKT细胞比例高于正常对照组(P<0.01)。
7小鼠骨髓和外周血涂片可见,正常组小鼠骨髓涂片中有核细胞增生活跃,模型对照组小鼠骨髓呈现造血抑制状态。经ICA处理后,实验组小鼠骨髓涂片和外周血涂片中均可见骨髓抑制状态有所改善。
8外周血血细胞计数结果显示:模型对照组小鼠WBC、RBC和PLT较正常对照组明显降低(P<0.01),而高、中、低浓度ICA均可明显提高实验组小鼠外周血WBC、RBC和PLT数量。
9于小鼠腹腔注射Cy10天后,模型对照组小鼠单根股骨骨髓细胞数量为7.03×106/femur,与正常对照组小鼠(10.36×106/femur)相比明显降低,差异有显著性(P<0.01),经高、中浓度ICA和参芪扶正注射液治疗后,小鼠单根股骨骨髓细胞数量与正常对照组相比,无显著性差异(P>0.05)。
结论:
1 ICA对免疫抑制小鼠的免疫器官具有很好的保护作用。
2 ICA可显著刺激小鼠脾T、B细胞的增殖,增强腹腔巨噬细胞、NK和CTL细胞的杀伤能力,显著增加免疫抑制小鼠腹腔巨噬细胞产生TNF-α、IL-12和脾细胞产生TNF-α等细胞因子的含量,上调小鼠脾淋巴细胞中CD3+T细胞和NKT(CD3+NK1.1)细胞的比例,可明显恢复免疫抑制小鼠细胞免疫和体液免疫功能。
3 ICA可显著改善免疫抑制小鼠的骨髓造血状态,提高骨髓细胞和外周血细胞数量,可明显恢复和改善造血功能。
4 ICA可显著恢复免疫抑制小鼠的免疫功能,提示其可作为抗肿瘤的辅助药物,减轻化疗引起的副作用,并具有良好的安全性,具有潜在的临床应用价值。