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利用生物催化合成精细化工上大量需要的手性化合物已经成为生物技术应用中的一个非常重要的领域。D-苹果酸是一种重要的手性化工材料,主要是应用于手性药物合成、手性添加剂、手性助剂等领域,具有广阔的开发前景。马来酸水合酶能够催化水合马来酸的加水而生成D—苹果酸。微生物转化马来酸制备D—苹果酸的是一条极具竞争力的制备方法,而催化酶马来酸水合酶的相关研究只停留在纯化和简单性质探讨阶段,进一步进行相关酶类的纯化、理化性质及酶动力学等研究,可为新型羟基合成酶系的开发提供理论指导。 本论文对Arthrobacter pascens DMDC12中所产的马来酸水合酶进行了分离纯化,详细研究了酶的性质。 DMDC12发酵后的菌体经破壁后得到粗酶液,粗酶再经离子交换层析、硫酸铵沉淀以及疏水层析等几步纯化后,得到了三种不同的马来酸水合酶:MHaseA, MHaseB和MHaseC。总酶活回收约41%,纯化倍数近十倍。这是在国际上首次从同一生物体内分离到了三种马来酸水合酶 酶学性质研究表明: 1.三种组分各自的最适催化温度和pH值都不一样,MHaseA的最适催化温度最高,MHaseA和MHaseB的最佳催化pH值偏碱性,而MHaseC则明显偏酸性。 2.Arthrobacter Passcens DMDC12是一株耐盐菌,表现在马来酸水合酶上,三个组分都有很高的耐盐性,高浓度的NaCl对酶活影响不大,而硫酸铵反而提高了酶活。 三个组分的酶活性中心可能不存在还原性的巯基,DTT的存在反而抑制了MHaseA和MHaseB。 低温下,三个组分不容易失活,添加一定的保护剂如硫酸铵、海藻糖、D,L—苹果酸等有利于酶的稳定。三个组分的稳定性有较大的差异,其中MHaseC组分显现出较好的稳定性。 3.三个组分的动力学常数也有较大的差异,MHaseA、MHaseB、MHaseC对马来酸催化的K_m值分别为1.874 mM、1.334mM和2.459mM。MHaseA、