目的:肌腱损伤是手外科中的多发损伤,肌腱缺损的修复是手外科临床常见病之一,常用的修复方法是自体肌腱移植、转位、延长及自体筋膜替代缺损肌腱,但自体肌腱来源有限,多条肌腱缺损的治疗仍是临床上一个亟待解决的难题。随着同种异体肌腱的研究制备,为肌腱缺损的治疗开创了一条新的途径;同种异体肌腱来源充足、取材方便、手术时间短,减少患者新的损伤及供区的功能影响。但是同种异体肌腱移植后发生的粘连问题一直是困扰临床广泛应用的最大难题。肌腱是一个少血供、少细胞的组织,有相对较低的抗原性。胶原并不表现抗原性,肌腱的抗原性主要存在于其腱细胞成分,主要是组织相容性抗原(HLA)。本课题采用TBP化学萃取法去细胞同种异体肌腱,制备出肌腱细胞去除完全,肌腱的生物力学无改变的去细胞同种异体肌腱移植物,从而更好的去除同种异体肌腱的免疫原性,防止肌腱外源性愈合,促进肌腱内源性愈合,减轻移植后的肌腱的粘连。方法:选用3个月龄健康雄性白色Leghorn鸡48只,平均1.9±0.053Kg。随机分为A、B、C三组,A组为TBP化学萃取法组、B组为深低温冷冻处理组,C组为空白对照组。本实验选用Lenghorn鸡双足第三趾为实验模型趾。取足趾掌侧纵行切口,长约10cm,切开皮肤后沿跖侧腱鞘浅层锐性分离,向侧方翻起皮瓣,暴露跖侧腱鞘,沿腱鞘正中纵行切开,长约10cm,于趾间关节伸直位趾深屈肌腱止点处横断趾深屈肌腱,分别将长、短腱纽于肌腱连接处离断,勿损伤肌腱端,向近端延长切口,仔细分离腱联合,游离出第三趾屈趾深肌腱,将其于小腿间关节部离断。取出肌腱,生理盐水漂洗,去除肌腱外膜。A组肌腱:40ml Tris缓冲溶液,PH=8.0,包括5mM EDTA,1%(v/v)TBP浸泡肌腱48小时,每24小时更换一次液体。再用40ml中性液体漂洗24小时,70%乙醇冲洗24小时(上述步骤均在振荡器上室温下进行)。肌腱保存在保温箱(37℃,5%CO2)和组织培养基中,包括10%胎牛血清,1%HEPES(羟乙基哌嗪乙磺酸),1%谷氨酰胺,0.4%艮他霉素,盘尼西林G200U/ml,链霉素200ug/ml,两性霉素B0.5ug/ml,备用;B组肌腱:浸泡于MEM液(含10%甘油)10-15分钟,无菌容器封装,贴标签记录取材日期、肌腱类型等项目,置于可控深低温冰箱内,逐步降温至-80℃,10d后测试;C组肌腱为空白对照组。对进行上述处理的三组肌腱分别行①形态组织学观察:分别在大体、HE染色及电镜三方面进行形态学观察分析;②生物力学测试:用Tytron-250生物力学试验机对三组肌腱分别行肌腱最大拉伸断裂强度(Pmax),肌腱最大拉伸断裂功耗(Wmax),及肌腱拉伸断裂延伸率(δmax)测定。③混合淋巴细胞培养测定:用含0.2%胶原酶RPM I1640液分别消化切碎的A、B、C组肌腱,分离获取细胞成分,调节浓度为1×106/ml,作为刺激细胞;同时采取受体鸡静脉血,用淋巴细胞分离液分离获取淋巴细胞,调节浓度为1×106/ml作为反应细胞.将刺激细胞分别等量与反应细胞混合培养,各组做3个复孔,混合培养5天后,吸取细胞悬液离心取沉淀制推片,瑞姬氏染色,光镜下计总淋巴细胞数(约500个)及转化细胞数,计算转化率如下:淋巴细胞转化率=转化细胞数/淋巴细胞总数×100%。计算各组3个复孔转化率均值,作为此组转化率.分别取10只供体鸡趾屈腱及10只受体鸡静脉血试验。所有统计结果采用方差分析。结果:①形态组织学观察:大体上:化学萃取法处理后肌腱呈瓷白色,表面有光泽,质柔软,韧性好,肌腱完整无缺损;深低温冷冻处理组肌腱为乳白色,表面无光泽,质柔软,韧性好,肌腱完整无缺损;空白对照组肌腱肌腱为乳白色,表面无光泽,质柔软,韧性好,肌腱完整无缺损。HE染色:化学萃取法处理的肌腱腱束间可见疏松结缔组织,胶原纤维平行密集排列整成束,束间无腱细胞存在;深低温冷冻处理的肌腱腱束间可见疏松结缔组织,胶原纤维平行密集排列成束,束间可见腱细胞排列成串;空白对照组肌腱腱束间可见疏松结缔组织,胶原纤维平行密集排列成束,束间可见腱细胞排列成串。透射电镜观察:化学萃取法处理的肌腱:无残留细胞,胶原原纤维排列规整,多呈波浪状,纤维间相互交联,纤维上有明暗交替的周期性横纹。深低温冷冻处理的肌腱:细胞无肿胀,细胞膜不清晰,胞核无变性,核膜完整,胞浆少,粗面内质网、线粒体无明显肿胀;胶原原纤维排列规整,多呈波浪状,纤维间相互交联,部分纤维肿胀,纤维间隙增大,纤维上有明暗交替的周期性横纹,横纹不清。空白对照组肌腱:细胞无肿胀,细胞膜清晰,胞核无变性,核膜完整,粗面内质网、线粒体无肿胀.胶原原纤维排列规整、紧密,纤维粗细均匀,多呈波浪状,纤维间相互交联,纤维上有明暗交替的周期性横纹,横纹清晰。②生物力学测试:肌腱最大拉伸断裂强度(Pmax):三组间差异无统计学意义(P=0.527);肌腱最大拉伸断裂功耗(Wmax):三组间差异无统计学意义(P=0.275);肌腱拉伸断裂延伸率(δmax):三组间差异无统计学意义(P=0.545)。综合三方面测试结果认为三组肌腱生物力学方面无显著差异。③混合淋巴细胞培养测定:实验结果显示:三组间差异有统计学意义(F=4.652,P=0.018)。化学萃取法处理组淋巴细胞转化率(1.85±0.63%),显著低于较深低温冷冻法处理组淋巴细胞转化率(6.89±1.05%)及未处理组淋巴细胞转化率(14.96±1.81%)(p值<0.05);深低温冷冻法处理组淋巴细胞转化率也低于未处理组淋巴细胞转化率(p值<0.05)。说明化学萃取法几乎消除了肌腱的免疫源性,深低温冷冻法显著降低了肌腱的免疫源性。结论:TBP化学萃取法处理肌腱去除腱细胞完全,并且安全不破坏细胞间的基质,几乎完全消除异体肌腱免疫原性,为异体肌腱的移植提供了新的方法。TBP化学萃取法处理同种异体肌腱较深低温冷冻法能够更加完全的去除肌腱免疫原性,而且对细胞基质及胶原纤维没有影响,生物力学性能无改变。更有利于体外培养的肌腱细胞回植于肌腱支架上,可以促进移植后的肌腱的内源性愈合,减少外源性愈合,从而减轻粘连的发生。