论文部分内容阅读
棉蚜能危害不同类型的多种农作物,因此棉蚜能进化出更好的解毒机制去应对来自宿主植物种类繁多的次生物质的能力是十分重要的。细胞色素P450单加氧酶可能涉及到昆虫对植物次生物质的解毒代谢途径中。本研究基于大规模测序、分子生物学研究及生物信息学分析,研究了 5个棉蚜P450基因的转录调控机理,旨在为探索棉蚜适应宿主次生物质起调控作用的功能性基因提供研究基础和可持续参考资料,为揭示棉蚜适应植物次生物质的分子调控机理提供理论帮助。主要的研究结果有:1.通过高通量测序,本文获得棉蚜的一个转录组数据库和五个数字表达谱数据库。将总量为53,763,866的原始测序数据组装成1,963,516条Unigene序列和28,555条独立基因。与没有经过任何处理的对照样本相比,在使用2-十三烷酮饲喂后,棉蚜体内有619条基因的表达量有显著变化(上调或者下调)。单宁、槲皮素和棉酚饲喂后,也分别有516、509和717条基因的表达量有变化。其中有4条P450基因和1条羧酸酯酶基因的表达量在四个植物次生物质处理组中同时下调。另外只有1条P450基因的表达量在三种植物次生物质处理组(2-十三烷酮、单宁酸和槲皮素)里可同时被诱导上调。以上结果表明棉蚜某些基因可以在植物次生物质的胁迫下被诱导表达。2.植物次生物质能够诱导昆虫体内P450基因的表达。为了更好地了解其诱导机制,本研究测定了棉蚜转录组和数字表达谱中五个P450基因在植物次生物质胁迫下的表达模式及它们的启动子活性。结果显示:CYP6CY19在三个CYP6亚家族基因中的表达量最高,其次是CYP6CY22和CYP6DA1。四种植物次生物质(棉酚、2-十三烷酮、单宁酸和槲皮素)都能够诱导这三个CYP6亚家族基因的表达,其中单宁酸的诱导效果要好于其他三种化合物。CYP305A1的表达量能被棉酚和2-十三烷酮显著诱导,而CYP4CJ1的表达量能被棉酚和单宁酸显著诱导。3.为了进一步探讨棉蚜P450基因被植物次生物质诱导的分子机制,本文克隆了五个P450基因的全长及其启动子区。通过瞬时转染昆虫细胞Sf9发现,CYP6DA1启动区-687～+586 bp,CYP6CY19 启动子区-666～+140 bp,CYP6CY22 启动子区-530～+218 bp,具有启动本底转录的活性。同时,CYP6CY19启动子区-157～+140bp、CYP6DA1启动子区-193～+56 bp和CYP6CY22启动子区-108～+218 bp含有对植物次生物质诱导响应的DNA顺式作用元件,在三个基因启动子上的一致序列为5’-C/TAC/ANCA/CA-3’。CYP305A1启动子区-810～-581 bp 和 CYP4CJ1启动子区-1173～-1422 bp也分别是响应植物次生物质的关键区域。另外本研究发现了一段位于CYP305A1启动子区和venom protease基因组序列长度为1094 bp的重叠区。当CYP305A1基因的表达量通过RNAi技术被干扰时,venom protease基因的表达量也随之下降。反之,敲除venom protease并不影响CYP305A1的表达。这些研究结果对于了解棉蚜对植物次生物质适应过程中,P450基因发挥的作用及P450表达调控、与其他基因相互作用的机理有所帮助。4.为进一步寻找能与上述P450基因启动子区响应植物次生物质调控的DNA顺式结合元件相互作用的转录因子,本研究采用酵母单杂交技术,找到了能与CYP4CJ1启动子区相互作用的12个猎物蛋白。其中Prey 3、Prey 4、Prey 5、Prey 6、Prey 8序列一致,与Prey 1为18sRNA;Prey 11为蚜虫内共生菌的基因,Prey 12为16sRNA。Prey 7与Prey 9序列一致。经过生物信息学分析显示,Prey 2蛋白可能为四类蚜虫(桃蚜、豌豆蚜、高粱蚜和麦双尾蚜)的表皮蛋白,Prey7为根瘤蚜的四种不同类型的AFLP片段,Prey10为柑橘木虱的两种非特征性序列。其中Prey2最有可能为目标猎物蛋白,已有研究显示昆虫表皮蛋白对昆虫的抗逆性有重要作用,且蚜虫昆虫表皮蛋白CPR家族基因RR-2类参与昆虫抗药性产生过程,这与本研究找到的RR-1类可能参与昆虫代谢植物有毒物质过程的结果一致。