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我国食管癌的发病率居世界首位,而河南省太行山区又是我国食管癌的高发地区。其具有侵袭性强、进展迅速、易复发且死亡率高等特点。目前,食管癌的治疗方法主要包括手术切除、化疗、放疗以及生物治疗等,其中化疗是治疗中晚期食管癌患者的主要手段之一。但在临床治疗过程中许多患者出现化疗抵抗,其原因主要是因为常规化疗药物可以激活肿瘤细胞周期检测点,从而通过相关信号传导通路,使受损DNA的自我修复,从而逃避凋亡。细胞周期检测点的激活是一种细胞的自我保护机制。当细胞受到化疗等因素损伤后,可激活多个DNA损伤周期检测点(G1/S、S、G2/M),将受损的细胞停滞于相应的检测点DNA修复,从而避免过多的细胞产生凋亡。在细胞周期检测点信号传导通路中细胞周期检测点激酶1(checkpoint kinase1, Chk1)起着重要作用。Chk1是细胞周期检测点最重要的丝氨酸/苏氨酸激酶,主要参与G2/M期细胞周期检测点信号传导。Chk1可能是迄今最合适消除G2期阻滞的靶分子。目前国内外学者主要采用Chkl siRNA及反义寡核苷酸技术沉默肿瘤细胞中Chk1表达,达到增强恶性肿瘤细胞放疗敏感性的目的。有关通过沉默Chk1达到增强恶性肿瘤细胞化疗敏感性的报道甚少,通过沉默Chk1达到增强食管癌细胞化疗敏感性的研究尚未见报道。顺铂是目前恶性肿瘤化疗的基本药物之一。然而大量的临床研究发现,含铂类药物的联合化疗方案的临床有效率明显降低,主要原因是由铂类引发的多药耐药即化疗抵抗,这也成为制约晚期恶性肿瘤临床治疗得主要原因。目前大量研究发现,常规化疗药物可造成肿瘤细胞不同类型的DNA损伤,进而激活DNA损伤检测点,促进肿瘤细胞DNA损伤修复,从而使细胞逃避凋亡。因此,DNA损伤检测点的功能状态在一定程度上决定了化疗的疗效好坏。本研究拟通过Chk1siRNA沉默食管癌细胞中Chk1的表达,体内外观察Chk1基因沉默后顺铂对食管癌化疗敏感性的影响,为临床增强食管癌等恶性肿瘤化疗敏感性奠定理论基础。本研究共分以下4个部分。第一部分Chk1在食管鳞癌组织中的表达及其意义方法1.采用免疫组织化学、Western blot、原位杂交、RT-PCR等技术分别检测食管鳞癌组织(62例)、癌旁不典型增生组织(31例)及正常食管黏膜组织(62例)中Chk1蛋白及mRNA的表达情况。2.统计学方法：应用SPSS13.0软件进行数据处理。采用x2检验、t检验和方差分析,并利用Spearman进行相关性分析。检验水准a=0.05。结果1.Chk1蛋白阳性表达主要定位于食管癌细胞的胞核及胞质内,呈棕黄色颗粒；Chk1mRNA阳性表达定位于食管癌细胞的胞质内,呈蓝紫色颗粒；二者在癌旁不典型增生组织及正常食管黏膜组织内阴性表达或低表达。2.免疫组化、Western blot及原位杂交、RT-PCR联合检测结果显示：在正常食管黏膜、癌旁不典型增生和食管鳞癌组织中,Chk1蛋白的阳性表达率依次升高,三者间两两相比差异均有统计学意义(P<0.05)；其mRNA表达水平亦依次升高,三者组间比较差异有统计学意义(P＜0.05)。3.在深层浸润组食管鳞癌组织中,Chk1蛋白、mRNA的表达均显著高于浅层浸润组,两组相比差异有统计学意义(P<0.05)。4.在有淋巴结转移组的食管鳞癌组织中,Chk1蛋白、mRNA的表达显著高于无淋巴结转移组,两组相比差异有统计学意义(P<0.05)。5.随着食管鳞癌分化级别的升高,鳞癌组织中Chk1蛋白、mRNA的表达依次升高,组间两两相比差异有统计学意义(P＜0.05)6.Chk1蛋白mRNA的表达与食管鳞癌患者的性别、年龄无关(P＞0.05)。第二部分Chk1siRNA表达载体的构建方法1.构建pSilencer3.1-Chk1siRNA重组载体。2.将3个已构建好的Chk1siRNA载体和一个阴性对照siRNA载体分别转染食管鳞癌EC9706细胞,并获得稳定细胞株。3.应用实时荧光定量PCR检测细胞中Chkl mRNA的相对表达量；运用Western blot方法检测细胞中Chk1蛋白的相对表达,挑选抑制效果最好的Chk1siRNA。4.统计学处理：应用SPSS11.0软件处理,采用x2检验、t检验和方差分析。检验水准α=0.05。结果1.成功构建了重组载体pSilencer3.1-Chkl siRNA1、pSilencer3.1-Chk1siRNA2和pSilencer3.1-Chkl siRNA3。2.三个Chk1siRNA载体转染食管癌EC9706细胞后,Chk1蛋白、mRNA的表达水平均显著低于未处理的EC9706细胞和对照siRNA组(P<0.05)。3.三个Chk1siRNA组之间相比,Chk1siRNA1和Chk1siRNA3之间Chk1mRNA表达无差异(P＞0.05),但均显著高于Chk1siRNA2组中Chk1mRNA的表达水平(P＜0.05)。第三部分Chk1siRNA干扰表达载体体外对顺铂抑制人食管癌EC9706细胞增殖、诱导其凋亡的影响方法1.食管癌EC9706细胞分组培养,即A组：正常组,未经任何处理：B组：Chk1siRNA2载体转染人食管鳞癌EC9706细胞24h后,再应用浓度为1Oμmol／L的顺铂再处理EC9706细胞12h；C组：10μmo1／L顺铂处理EC9706细胞12h。2.采用免疫细胞化学、Western blot和原位杂交、RT-PCR方法检测各组细胞中Chk1蛋白和mRNA的表达。3.采用MTT方法观察各组细胞增殖情况。4.运用TUNEL法、流式细胞术等方法检测各组细胞凋亡情况。5.统计学处理：应用SPSS13.0软件处理,计数资料采用x2检验、计量资料行t检验或方差分析,检验水准a=0.05。结果1.MTT法检测结果：B组(Chk1siRNA2+顺铂)与C组(顺铂)及A组(正常对照组)相比,细胞生长抑制率明显增加,差异均有统计学意义(P<0.05)。2.免疫细胞化学及Western blot检测结果：B组(Chk1siRNA2+顺铂)与C组(顺铂)及A组(正常对照组)相比,食管癌EC9706细胞中Chk1蛋白表达明显下调,组间两两相比差异均有统计学意义(P＜0.05)。3.原位杂交及RT-PCR检测结果：B组(Chk1siRNA2+顺铂)细胞中Chk1mRNA表达明显低于C组(顺铂)及A组(正常对照组),组间两两相比差异均有统计学意义(P＜0.05)。4. TUNEL方法检测凋亡结果：B组(Chk1siRNA2+(?)顺铂)细胞中凋亡指数(AI)明显高于C组(顺铂)及A组(正常对照组),组间两两相比差异均有统计学意义(P＜0.05)。5.流式细胞仪检测凋亡结果：B组(Chk1siRNA2+顺铂)早期凋亡细胞数和晚期凋亡细胞数均较C组(顺铂)及A组(正常对照组)明显增加,且差异均有统计学意义(P均＜0.05)。第四部分Chk1siRNA干扰表达载体体内对顺铂诱导的食管癌移植瘤细胞生物学行为的影响方法1.培养食管癌EC9706细胞,构建裸鼠食管癌移植瘤模型。2.分组饲养荷瘤裸鼠,即A组：正常组,瘤体注射无菌生理盐水；B组：瘤体注射Chk1siRNA2加浓度为(5mg/kg)的顺铂；C组：瘤体注射顺铂(5mg／kg)。各组均每3天1次,共5次。3.观察各组移植瘤的生长状况。4.采用免疫组化、Western blot和原位杂交、RT-PCR方法检测各组移植瘤组织中Chk1蛋白和mRNA的表达。5.运用TUNEL法方法检测各组细胞凋亡情况。6.统计学处理：应用SPSS13.0软件处理,计数资料采用x2检验、计量资料行t检验或方差分析,检验水准a=0.05。结果1.B组(Chk1siRNA2+J顷铂)移植瘤体积明显小于C组(顺铂)及A组(正常对照组),组间两两相比,均有统计学差异(P＜0.001)。2.免疫组化及Western blot检测结果：B组(Chkl siRNA2+顺铂)食管癌移植瘤组织中Chk1蛋白表达明显低于C组(顺铂)及A组(正常对照组),组间两两相比差异均有统计学意义(P＜0.05)。3.原位杂交及RT-PCR检测结果：B组(Chkl siRNA2+(?)顺铂)移植瘤组织中Chk1mRNA表达显著低于C组(顺铂)及A组(正常对照组),组间两两相比差异均有统计学意义(P＜0.05)。4. TUNEL方法检测结果：B组(Chk1siRNA2+(?)顺铂)细胞中凋亡指数(AI)明显高于C组(顺铂)及A组(正常对照组),组间两两相比差异均有统计学意义(P＜0.05)。全文结论1.Chk1在食管鳞癌组织中存在高表达。2.Chk1蛋白及mRNA表达与食管鳞癌发生发展及浸润转移有关。3.成功构建了三个Chkl siRNA载体。4. Chkl siRNA2具有最好的抑制效果。5. Chkl siRNA干扰表达载体可体外下调人食管癌EC9706细胞中Chkl蛋白及mRNA表达。6.沉默Chk1表达可体外增强顺铂抑制人食管癌EC9706细胞增殖、诱导其凋亡的敏感性。7.成功构建了裸鼠食管癌移植瘤模型。8.沉默Chk1表达,可体内增强顺铂对裸鼠食管癌移植瘤生长抑制,诱导移植瘤细胞凋亡的效应。全文总结论1.Chk1在食管鳞癌组织中存在高表达。2.Chk1蛋白及mRNA表达与食管鳞癌发生发展及浸润转移有关。3.成功构建了三个Chkl siRNA载体。4. Chkl siRNA2具有最好的抑制效果。5. Chkl siRNA2可体外下调人食管癌EC9706细胞中Chk1蛋白及mRNA表达。6.沉默Chk1表达可体外增强顺铂抑制人食管癌EC9706细胞增殖、诱导其凋亡的敏感性。7.成功构建了裸鼠食管癌移植瘤模型。8.沉默Chk1表达,可体内增强顺铂对裸鼠食管癌移植瘤的生长抑制,促进其诱导移植瘤细胞凋亡的效应。