论文部分内容阅读
背景和目的:幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,Hp）可引起慢性胃炎、胃溃疡、十二指肠溃疡等上消化道疾病,并与胃癌、胃粘膜相关淋巴组织淋巴瘤的发生有关。现阶段临床治疗Hp感染仍然采用抗生素,但此种治疗手段存在患者依顺性差、费用昂贵、毒副作用强及日趋严重的细菌耐药性等问题。天然植物成份可以避免这些弊端,目前已有研究发现,一些天然植物成份对Hp表现出一定的抗菌效果,包括天然植物成份乳香胶、大蒜油、黄连等。本研究选用乳香胶和公认抗菌谱较广的大蒜油、黄连提取物及小檗碱作研究对象,对这几种天然植物成份抗Hp活性进行了初步研究,通过体外和体内试验探明其体外抗菌活性及清除Hp的疗效,通过耐药性诱导反应实验研究和毒理学研究探讨其耐药性和安全性,通过药代动力学研究,确定药代动力学参数,为药物的开发和评价提供理论依据。方法:1.天然植物成份体外抗菌活性研究。琼脂平板二倍稀释法测定最低抑菌浓度（MIC）;试管二倍稀释法测定最低杀菌浓度（MBC）;菌落计数法绘制杀菌曲线;探索接种量及培养基pH值对药物所测MIC的影响;扫描和透射电镜观察药物作用前后细菌形态结构的变化。2.天然植物成份体内抗Hp活性实验。（1）乳香胶治疗剂量筛选试验。将感染沙鼠180只分为乳香胶药物剂量组（15mg、7.5mg、3.75mg）、溶剂治疗组、未用药治疗组和阳性药物治疗组（奥美拉唑3mg和克拉霉素2mg）,分别对它们连续用药治疗14d。在用药治疗第8d、停药后第1d、停药后第20d宰杀沙鼠,取胃组织分别做尿素酶实验、组织病理学检查、分离培养、PCR检测。观察清除率。（2）多种天然植物成份清除率比较试验。将感染沙鼠140只分为15mg乳香胶组、15mg大蒜油组、15mg黄连提取物组、15mg小檗碱组、溶剂治疗组、未用药治疗组和阳性药物治疗组（奥美拉唑3mg和克拉霉素2mg）,分别对感染沙鼠连续用药治疗14d,Hp全菌疫苗在0、1、2、3w肌肉注射免疫沙鼠及其与15mg乳香胶共同治疗,在停药后第1d、停药后第20d或免疫结束第14d宰杀沙鼠,取胃组织分别做尿素酶实验、组织病理学检查、分离培养、PCR检测。观察清除率。3.Hp的体外耐药诱导实验。采用多步诱导法,选用临床耐药率很高的抗生素甲硝唑和目前抗Hp疗效好的抗生素克拉霉素做对照。在乳香胶、大蒜油、黄连提取物、小檗碱、甲硝唑和克拉霉素浓度逐渐增加的培养基上转种Hp,观察MIC的变化。将敏感性下降的诱导株在无药培养基上转种3次后,检测其MIC值。测定乳香胶、乳香胶、大蒜油、黄连提取物和小檗碱对甲硝唑、克拉霉素敏感性下降诱导株的MIC值。4.以抑菌效应法指标检测乳香胶的药代动力学参数。5.通过急性毒性试验和长期毒性试验对乳香胶进行毒理学研究。按最大耐受剂量法,灌服小鼠,观察7d内小鼠的死亡情况;每天按不同剂量灌服大鼠1次,连续30天,检测血液、生化学指标,脏器重量及重量检测,脏器组织做病理切片。结果:1.四种天然植物成份均表现体外抗菌活性。乳香胶、大蒜油、黄连提取物和小檗碱对HpSS1的MIC值分别为125ug/ml、82.5ug/ml、1000ug/ml和500ug/ml;对金葡球菌ATCC25923的MIC值分别为1000ug/ml、82.5ug/ml、4000ug/ml和2000ug/ml;对大肠杆菌ATCC25922的MIC值分别为2000ug/ml、330ug/ml、8000ug/ml和2000ug/ml。它们对HpSS1的MBC为500ug/ml、165ug/ml、1000ug/ml和500ug/ml;对金葡球菌ATCC25923的MBC值分别为2000ug/ml、330ug/ml、8000ug/ml和4000ug/ml;对大肠杆菌ATCC25922的MBC值分别为8000ug/ml、1320ug/ml、32000ug/ml和8000ug/ml。从杀菌曲线看,三种药物在浓度为1/2MIC和1/4MIC时,三个菌株均比对照菌株增菌缓慢。当浓度提高到2MIC和4MIC时,对Hp,金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均表现出较强的杀菌作用,存在明显的量效关系。乳香胶的体外抗菌活性可受接种菌量,培养基pH值的影响。当接种量增加至109CFU/ml,培养基pH值减小为4.0或增加为9.0时,乳香胶的抗菌活性减弱。乳香胶作用Hp后,电镜下可见一些形体变小,胞质稀疏的个体,细胞壁有破损,胞质外溢。2.天然植物成份体内抗Hp活性实验。（1）用乳香胶治疗第8d后,3.75mg剂量组清除是25%,7.5mg剂量组清除率是0%,15mg剂量组清除率是50%,停药后第1d后,三个剂量组的清除率都为100%。停药后第20d后,3.75mg剂量组清除率是25%,7.5mg剂量组清除率是50%,15mg剂量组清除率是100%。阳性性药物治疗组三个时间段清除率均为100%。（2）应用天然植物成份乳香胶、大蒜油、黄连提取物、小檗碱及Hp全菌疫苗,乳香胶+Hp全菌疫苗对感染沙鼠进行清除治疗,用药后第1d后,前四种药物清除率分别为90%、70%、70%和60%。用药后第20d后,它们对感染沙鼠的清除率为100%、80%、70%、70%、70%和100%,阳性性药物治疗组两个时间段清除率均为100%。3.Hp的体外耐药诱导实验。在体外耐药诱导培养过程中,乳香胶、大蒜油、黄连提取物和小檗碱组的MIC值保持不变,即未诱导出对乳香胶、大蒜油、黄连提取物和小檗碱耐药的Hp菌株,而在含64MIC甲硝唑的培养基上菌株仍能生长。在培养过程中,菌株对甲硝唑的敏感性逐渐下降,MIC值逐渐升高,最后达到64μg·mL-1。甲硝唑耐药株（MR）在无药培养基上转种10次后得到MR’,MIC值不变。乳香胶、大蒜油、黄连提取物和小檗碱对MR的MIC没有影响。4.乳香胶的药动学参数为:Ka=0.666 h-1,Ke=0.143 h-1,t1/2（Ka）=1.041 h,t1/2（Ke）=4.856h,Lagtime=0.574h,T（peak）=3.0h,C（max）=0.9503ug/ml,AUC=3.2605ug/ml·h,CL/F=38.03g/kg·h/（ug/ml）,V/F=266.8（g/kg）/（ug/ml）。5.小鼠7d内无死亡,大鼠一般状况、血象、血液生化学指标、脏器重量及重量指数检测未见异常,病理切片无异常改变。结论:1.乳香胶、大蒜油、黄连提取物和小檗碱均有抗幽门螺杆菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌活性。2.乳香胶在体内治疗Hp感染有效,但停药后实验小剂量组有复发。15mg剂量组清除率为100%,而且没有复发。15mg乳香胶与相同剂量的大蒜油、黄连提取物、小檗碱及Hp全菌疫苗比较,在体内试验中,他们均是有效的,乳香胶组效果最佳。乳香胶与Hp全菌疫苗共同使用,没有产生相互拮抗的作用。3.Hp对乳香胶、大蒜油、黄连提取物和小檗碱不易产生耐药性,甲硝唑诱导出高度耐药株,且甲硝唑耐药株对乳香胶、大蒜油、黄连提取物和小檗碱仍保持敏感,乳香胶、大蒜油、黄连提取物和小檗碱是有良好开发前景的抗Hp感染的天然药物。4.乳香胶的药动学过程符合一室开放模型。该药灌胃给药后,吸收较为迅速,而消除则相对较为缓慢。5.乳香胶经小鼠急性毒性试验和大鼠长期毒性试验,均未见明显的毒性作用,拟用剂量使用安全。