胡椒（Piper nigrum L.）作为重要的胡椒目胡椒科植物之一,其最早发现于印度,现已广泛种植于世界上多个热带地区。国际粮农组织（FAO）2019年度数据展示了,我国胡椒的种植面积和产量均稳居世界第五,在我国农业发展中有着重要的地位,是助力于我国乡村振兴、服务国家“一带一路”倡议的特色香料产业。胡椒碱在胡椒中是重要的功能物质和品质指标,决定了胡椒独特的风味口感和药用价值。‘热引1号’（属于印尼大叶种的改良品种）在我国胡椒主产区种植面积最广,其胡椒碱含量仅为4.80%,与国际上高品质胡椒在胡椒碱含量指标上仍有较大差异。胡椒碱含量低,胡椒品质不高,胡椒的分子育种技术受限等,已然成为制约我国胡椒产业发展的瓶颈之一。本课题组在前人的基础上总结了胡椒碱生物合成的路径,哌啶和胡椒酰胺辅酶A（Piperoyl-Co A）是胡椒碱生物合成的直接前体物质。胡椒酰胺辅酶A充当反应中的酰基供体,它以苯丙烷途径中C6-C3苯丙基化合物为基本单元,通过羟基化、脂肪酸链延伸等反应生成,是不可或缺的胡椒碱合成环节,最终胡椒酰胺辅酶A与哌啶通过酰基转移反应生成胡椒碱。其中,BAHD酰基转移酶参与的反应即酰基转移反应在胡椒碱合成途径中起着至关重的作用。酰基转移反应是连接多胺物质和酚类物质代谢的纽带,能够精准控制胡椒碱的合成,也是影响胡椒酰胺物质多样的重要因素。本研究以胡椒基因组测序数据和转录组测序数据为基础,发现胡椒中广泛存在BAHD酰基转移酶家族基因,对其进行生物信息学分析。同时,以胡椒根、茎、叶、花及开花后不同时期的胡椒果实为材料,通过胡椒碱累积模式分析、WGCNA分析、q RT-PCR验证基因表达模式等,筛选出胡椒中参与胡椒碱合成的BAHD酰基转移酶基因。对候选的胡椒BAHD酰基转移酶基因进行克隆、诱导表达。主要研究结果如下:1、从胡椒基因组和转录组中鉴定出BAHD酰基转移酶基因78个,通过与来自28个物种中已鉴定的80个BAHD家族基因进行比对,发现胡椒BAHD家族可以分为7类。与前人对植物BAHD家族的分类相比,胡椒中的BAHD家族基因缺失分支II成员。78个胡椒BAHD酰基转移酶基因不均匀分布于胡椒23条染色体中,其中在第1号染色体上成串联重复分布。2、针对筛选出的78个BAHD酰基转移酶,开展多序列比对和Motif分析,结果显示,除植物BAHD酰基转移酶所共有的DFGWG、HXXXD结构域外,新发现胡椒BAHD酰基转移酶序列中存在另一个相对保守的特征结构域YFGN,表明胡椒BAHD酰基转移酶与其他物种存在差异。胡椒BAHD家族蛋白成员间理化性质差异较大,编码氨基酸数介于245 aa-578 aa,分子量在26.37 k Da和62.72 k Da之间。酸性不稳定、高亲水性蛋白在胡椒BAHD酰基转移酶成员中占据一半以上。3、胡椒碱在胡椒果实中优势积累,随着果实的成熟,含量逐步升高。以胡椒碱的分布情况、积累模式为基础,通过对胡椒BAHD基因表达模式进行验证和WGCNA相关性分析,进一步筛选参与胡椒碱合成的BAHD酰基转移酶基因。初步筛选出参与胡椒碱生物合成的候选BAHD酰基转移酶基因有Pn1.3303、Pn1.3375、Pn6.2477、Pn6.2521、Pn11.2248、Pn11.2279、Pn12.1813,其表达模式与胡椒碱累积特征相一致。4、为进一步鉴定出参与胡椒碱生物合成的BAHD基因。根据上述7个候选基因在23个胡椒不同组织中的表达模式,选取与胡椒碱积累模式一致、种子中基因表达量最高,同时该基因处于BAHD基因簇边缘区域的Pn1.3303、Pn1.3375（其编码的氨基酸序列包含完整且未发生突变的特征结构域,DFGWG、HXXXD、YFGN）进行克隆。其中,Pn1.3303扩增序列包含1524个碱基对,ORF（开放阅读框）长度为1353bp,编码450个单位的氨基酸;Pn1.3375扩增序列包括1462个碱基对,ORF长度为1353 bp,编码450个单位的氨基酸。5、采用Gateway方式将Pn1.3303、Pn1.3375连接原核表达p GEX-4T-1载体。成功诱导表达出N末端与GST标签融合的目的蛋白。研究结果为鉴定胡椒碱生物合成中相关BAHD酰基转移酶提供了重要的基因资源。