【摘 要】
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Clip结构域丝氨酸蛋白酶(clip-domain serine protease,CLIP)是一类种类繁多的蛋白水解酶,在昆虫先天免疫中起着至关重要的作用。先天免疫应答是蚊子抵抗病原微生物入侵的第一道屏障,其中Toll通路、免疫缺陷(IMD)途径和黑色素形成过程是埃及伊蚊先天免疫的主要途径。根据序列特异性和系统发育关系,将CLIP分为5个亚科(CLIPA、CLIPB、CLIPC、CLIPD和CL
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Clip结构域丝氨酸蛋白酶(clip-domain serine protease,CLIP)是一类种类繁多的蛋白水解酶,在昆虫先天免疫中起着至关重要的作用。先天免疫应答是蚊子抵抗病原微生物入侵的第一道屏障,其中Toll通路、免疫缺陷(IMD)途径和黑色素形成过程是埃及伊蚊先天免疫的主要途径。根据序列特异性和系统发育关系,将CLIP分为5个亚科(CLIPA、CLIPB、CLIPC、CLIPD和CLPE)。本实验利用生物信息学研究方法,使用在线软件Clustal Omega分析埃及伊蚊(Aedes aegypti)8个CLIPs在物种间的相似性,利用在线工具SOPMA对其二级结构进行预测,利用MEGA 7软件构建系统进化树,了解其在昆虫中的进化关系;通过实时荧光定量PCR(q RT-PCR)方法研究埃及伊蚊6个CLIPs基因从卵到成虫的发育时期及未吸血雌蚊不同组织中的表达情况;通过细菌侵染雌性成蚊,研究6个CLIPs基因对不同种类细菌感染时的诱导动力学;然后确定了CLIPB15和CLIPB22这两个基因对真菌侵染和组织损伤是否有反应。利用RNA干扰(RNAi)技术研究它们对细菌和真菌感染的防御作用;探讨了细菌感染后NF-κB转录因子REL1和REL2在Toll通路和IMD途径中的表达水平。最后,研究了CLIPB15和CLIPB22干扰的雌蚊体内酚氧化酶活性变化。从NCBI的GenBank数据库中得到埃及伊蚊8个CLIPs基因序列,通过生物信息学分析,发现其氨基酸序列在羧基端蛋白酶结构域同源性较高,在蛋白的二级结构中,无规卷曲所占比重最高。系统发育分析表明,埃及伊蚊8个CLIPs基因在进化树中存在3个不同的分支,其中一个分支与白纹伊蚊PPAF1有较高的同源性,1个分支与冈比亚按蚊2个CLIPs有较高的同源性,另1个分支与黑腹果蝇SP5有较高的同源性。时空表达谱结果显示,埃及伊蚊6个CLIPs基因在4龄幼虫和成蚊中表达水平较为丰富,在蛹期表达水平均较低,在雌性成蚊不同组织中表达水平相似,胸部和脂肪体中均有较高的表达水平,而在马氏管、中肠和卵巢中的表达水平均较低。在细菌感染方面,埃及伊蚊6个CLIPs基因有着不同的诱导动力学,存在应对微生物侵染时的特异性反应。同时真菌白僵菌感染以及组织损伤均可上调CLIPB15和CLIPB22这两个基因的m RNA水平。RNAi介导的CLIPB15基因沉默后,血淋巴中PO活性显著降低。RNAi实验显示,这两个基因都参与了对细菌和真菌感染的免疫防御。同时,Toll通路和IMD途径中NF-κB转录因子REL1和REL2的m RNA表达水平变化在感染细菌组和对照组之间存在差异。综上所述,埃及伊蚊8个CLIPs基因功能主要与埃及伊蚊先天免疫相关,并且CLIPB15和CLIPB22这两个基因会影响成蚊抵抗微生物侵染的能力并且对Toll通路和黑化途径都有一定的影响。
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