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三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)作为中国特有的河蚌资源,其所产珍珠精细滑润,光色亮丽。有研究表明雄蚌育珠性能优于雌蚌。近年来,有关三角帆蚌的种质资源保护、产珠性能、病害防治及人工繁育等方面的研究取得了一定成果,而目前关于双壳贝类性别决定的机制还不清楚,而性别相关基因的研究也不多见。因此,本实验从已有三角帆蚌cDNA转录组库中筛选了3个与性腺发育相关的基因:Dmrta2-1、Dmrta2-2、Lhx9,分离鉴定其全长及分析序列结构生物学信息,通过荧光定量表达、原位杂交信号检测及RNA干扰实验研究它们在淡水珍珠蚌性别方面发挥的作用,主要研究结果如下:1.三个基因的克隆及序列分析通过RACE扩增拼接获得基因全长序列,其中Dmrta2亚家族两个基因同源性较高,将其命名为Dmrta2-1和Dmrta2-2。Dmrta2-1核苷酸序列全长1 723 bp(Genbank登录号:MK372349),ORF(Open reading frame)1 158 bp,编码385个aa(amino acid),5’非翻译区(untranslated region,UTR)237 bp,3’UTR为328 bp。预测理论等电点PI/蛋白相对分子量MW为4.97/143293.27,不含信号肽与跨膜区域,Prot Scale程序预测蛋白疏水性表现为亲水性蛋白。Dmrta2-2全长1 682 bp(登录号:MK372348),ORF区1 170 bp,编码389个aa,340 bp的5’UTR与172 bp的3’UTR。PI 6.75,MW 42 568.48,没有预测到信号肽,也没有跨膜区,为亲水性胞内蛋白(平均值为-0.643)。NCBI预测两个Dmrta2基因保守位点,均存在1个DM保守结构域和1个DMA保守基序,且氨基酸序列比对及系统演化树都表明三角帆蚌与池碟蚌(Hyriopsis schlegelii)亲缘度很高,在进化树中聚为一小支,进化地位较保守。Lhx9基因cDNA全长为1 931bp(登录号:MN006952),ORF为531 bp,编码176个aa,还包括36 bp的5’UTR与1 364 bp的3’UTR。预测p I/Mw为6.21/20174.25,氨基酸亲疏水性预测指数为负值,即亲水性。NCBI预测存在一个保守的Homebox(HM)同源结构域。同其他物种Lhx9氨基酸序列比较相近,发育树中与牡蛎、扇贝聚为一大支,其结构与功能的进化关系比较保守。2.三个基因的qRT-PCR表达分析Dmrta2-1基因在2龄成熟蚌的性腺、鳃、肝脏、肾脏、外套膜、闭壳肌及斧足中均表达,除了肝脏,其它各组织中雌雄表达差异表现为极显著(p<0.01),其中雌性性腺表达明显高于雄性。对早期不同发育阶段(0D-8M)的性腺表达在1月龄出现最高值,8月龄表达量次之。推测可能主要参与性腺发育过程。Dmrta2-2基因在2龄雌雄蚌闭壳肌中表达水平最高,除了肝脏雌雄各组织表达差异显著(p<0.05)。早期表达在第3天达到最高,3月龄次之。Dmrta2-2基因在1～3龄成熟雌雄性腺表达中雌性均高于雄性,且在1、2龄中差异极显著,在1龄中雌雄表达量最高,雄性表达水平较低且稳定。推测可能与两性分化、雌性性腺发育及雄性性腺功能的稳定维持等有关。Lhx9在2年龄成体蚌的雌性性腺中出现特异性表达,除去外套膜,在其它各组织的表达都雌性高于雄性,且性腺与斧足中两性差异极显著。早期性腺表达中胚胎发育第3天值最高,其它时间点分布稳定,表达值较低。12-36月龄性腺表达中,雌性均高于雄性,从12-19月龄期间表达量不断下降,之后至36月龄表达量不断上升,但低于12月龄表达值,雄性性腺呈现出相似的变化趋势,但表达丰度很低。由此推测Lhx9基因可能参与三角帆蚌雌性性别分化、性腺发育及两性成熟性腺功能稳定的维持。3.三个基因在性腺中的ISH分析在2龄成熟精卵巢原位杂交实验中,Dmrta2-1基因的表达信号在精卵巢中都有检测到,在卵巢中主要位于卵母细胞的细胞膜上,表达信号较强;而雄性存在于滤泡壁,表达信号微弱。同样,Dmrta2-2基因在2龄成熟精卵巢的原位杂交实验,在卵巢中检测到较明显的表达信号,主要存在卵母细胞的细胞膜上,在精巢的滤泡壁中检测到表达信号,推测两个Dmrta2基因都主要在卵巢分化中起作用。Lhx9基因在2龄成熟精卵巢的原位杂交实验中,在卵巢卵母细胞的细胞膜上检测到明显的表达信号,在精巢的精细胞中信号很弱,推测Lhx9可能主要与三角帆蚌雌性性腺发育及分化过程。4.RNAi探究基因的功能预实验中通过合成Tra-2a基因ds Tra-1、2、3链,注射7天后检测发现ds Tra-3在雄性性腺中干扰率达到70.44%,雌性为50.98%,为较理想干扰链。正式干扰中累积注射ds Tra-3链3次,发现沉默Tra-2a后Dmrta2-2基因在雄性性腺中表达量明显下降,沉默率达到62.20%,雌性中未出现下降。由此推测三角帆蚌中Tra-2基因对Dmrta2可能有一定调控作用,在性腺发育中发挥重要作用。选用1龄蚌,在闭壳肌中注射Ds-Lhx9双链后,发现Lhx9基因在雌性性腺中的表达明显减弱,相比对空白组,干扰效率达到69.16%;在雄性性腺中干扰效率仅为12.14%。推测Lhx9在三角帆蚌性腺发育尤其雌性中发挥重要功能。以上结果为后期建立更有效的三角帆蚌RNA干扰技术,研究其性别调控机制提供数据支持。