三种植物精油对黄芪根腐病菌的抑菌活性及机理研究

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黄芪(Astragalus membranaceus)为豆科多年生草本植物,具有极高的经济和药用价值。近年来,黄芪根腐病在甘肃渭源县、陇西县、山西浑源县发病严重,对黄芪的产量和品质造成巨大损失。目前主要依靠轮作和化学杀菌剂防治黄芪根腐病,但其防治效果甚微。因此,本研究旨在寻找和开发有效广谱的生物杀菌剂防治黄芪根腐病。本文以茄腐镰刀菌(Fusarium solani)为指示菌,通过体外实验评估植物精油的抗菌活性,观察处理前后菌体形态变化,分析精油对菌体细胞膜完整性和通透性的影响;进一步检测菌体内丙二醛含量、线粒体膜电位、活性氧含量以及抗氧化酶活性的变化;最后采用盆栽试验测试植物精油对黄芪根腐病的防效。主要研究结果如下:(1)利用GC-MS技术分析出肉桂精油的主成分为肉桂醛(C9H8O),占比达到82.90%,丁香精油中丁香酚(C10H12O2)为主要化合物,相对含量为70.63%,牛至精油的主成分为香芹酚(C10H14O,77.65%)。通过最小抑菌浓度法,发现6种精油对F.solani均有抑菌效果,活性由强到弱依次为:香芹酚、牛至油(200μL L-1)>肉桂醛(300μL L-1)>肉桂精油(350μL L-1)>丁香酚(400μL L-1)>丁香精油(500μL L-1)。(2)体外试验结果表明肉桂醛、香芹酚、丁香酚能有效抑制F.solani菌落生长,具有剂量依赖性,EC50分别为178.68、92.39和263.00μL L-1。此外,肉桂醛、香芹酚、丁香酚显著抑制F.solani孢子萌发,当其浓度分别为120、160和140μL L-1时,对应的孢子萌发抑制率分别为99.61%、98.42%和94.18%。通过扫描电镜观察发现精油处理F.solani后,菌丝体出现不规则收缩,视野有明显的干瘪、凹陷和断裂等现象。碘化丙啶染色观察到精油处理后F.solani细胞膜完整性遭到破坏。同时上清液中电导率和蛋白质含量与精油处理时间和浓度成正比,说明精油破坏了F.solani细胞膜的通透性。通过对F.solani菌体中麦角固醇的定量分析,发现精油显著抑制菌体内麦角固醇的合成,且麦角固醇含量减少率和精油浓度呈正相关。(3)肉桂醛和丁香酚可以引起F.solani菌体内产生氧化胁迫,致使菌体内MDA含量显著增加,线粒体膜电位降低,活性氧在体内大量积累,从而对菌体造成氧化损伤。通过RT-q PCR试验分析产生ROS的NADPH氧化酶相关基因的转录水平,结果表明肉桂醛可以显著上调Fs Nox R的表达水平,丁香酚可以上调Fs Nox R、Fs Rac和Fs Nox B的表达水平,以致于活性氧在体内大量产生。此外,肉桂醛、丁香酚抑制了F.solani菌体内POD和SOD的活性,进一步加重了胞内活性氧的积累,600μL L-1肉桂醛相比于对照组对F.solani内POD和SOD活性抑制率分别为28.69%和41.62%,800μL L-1丁香酚对POD和SOD的抑制率分别为33.10%和34.15%。(4)肉桂醛和丁香酚显著降低F.solani纤维素酶和果胶酶活性,从而减轻F.solani的致病力。通过体内试验表明精油处理能显著降低F.solani在黄芪根部侵染、定植,明显减小黄芪根部病斑面积,600μL L-1肉桂醛和800μL L-1丁香酚处理7 d后,黄芪根腐病斑面积与对照组相比分别降低了93.97%和89.64%。盆栽试验表明600μL L-1肉桂醛处理后,治疗组防效为92.98%,预防组防效为83.33%,同样,800μL L-1丁香酚处理后治疗组和预防组防效分别为85.45%和84.55%。因此,肉桂醛和丁香酚均能用于黄芪根腐病的防治。
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