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研究背景糖尿病心肌病（Diabeticcardiomyopathy,DCM）是糖尿病最常见的并发症之一,通常表现为无高血压或冠心病的糖尿病患者特有的心肌结构和功能异常。由于DCM发病机制复杂,且缺乏有效治疗方法,故一直是近年来的研究热点。（前）肾素受体[（Pro）renin receptor,PRR]是肾素的特异性受体,作为肾素血管紧张素系统（Renin-angiotensin system,RAS）的重要组分,有研究表明其是糖尿病发病及其导致终末器官损害的关键因素。焦亡,作为一种伴随炎症级联反应的新型细胞死亡方式。有研究表明,核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白 3（Nucleotide binding oligomerization domain-like receptor protein 3,NLRP3）介导的细胞焦亡参与DCM的病理过程。此外,还发现通过激活腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase,AMPK）可抑制 NLRP3 介导的 DCM 心肌焦亡。但目前尚不明确PRR是否通过AMPK-NLRP3途径参与DCM心肌焦亡,故探讨PRR对DCM心肌细胞焦亡的影响及其机制,可能为治疗DCM提供新的靶点和思路。研究目的1.构建DCM大鼠模型,观察DCM心肌组织中PRR、AMPK、NLRP3等焦亡相关蛋白表达情况;2.构建 PRR 过表达腺病毒（PRR overexpression adenovirus,Ad-PRR）,观察 PRR 过表达对DCM心肌组织中AMPK、NLRP3等焦亡相关蛋白表达水平、纤维化水平及心功能的影响;3.用高糖刺激心肌细胞,观察PRR、AMPK、NLRP3等焦亡相关蛋白表达水平;应用Ad-PRR及AMPK激动剂（GSK621）干预心肌细胞,观察PRR过表达对高糖刺激下心肌细胞焦亡的影响及调控机制。研究方法1.构建PRR过表达腺病毒:根据大鼠的PRR基因序列（Gene ID:302526）,委托上海吉玛公司构建腺病毒包被的PRR基因过表达载体（PRR overexpression adenovirus,Ad-PRR）,同时构建空病毒载体（Empty vector adenovirus,Ad-EGFP）作为病毒对照。2.构建DCM模型:选取60只8周龄的Wistar大鼠,适应性喂养一周后,随机分为2组:对照组（n=15）、糖尿病组（n=45）,其中,糖尿病组大鼠在空腹12h后腹腔大剂量注射链脲佐菌素（STZ,65mg/kg）。注射1周后,3次随机血糖均大于11.1mmol/L,并伴有多饮多尿多食等症状的大鼠视为糖尿病造模成功。在糖尿病造模成功12周后,对各组大鼠行超声心动图检查心功能,当心腔扩大、收缩功能减弱则视为DCM造模成功。随后,DCM大鼠随机分为3组,每组15只,具体为DCM组、DCM+PRR过表达腺病毒组（Ad-PRR组）、DCM+空载体腺病毒对照组（Ad-EGFP组）,并分别经尾静脉注射100μL无菌PBS缓冲液、Ad-PRR（1 × 109PFU,溶于100μL无菌PBS缓冲液）、Ad-EGFP（1 × 109PFU,溶于100μL无菌PBS缓冲液）。在给予腺病毒注射处理2周后,从每组随机取3只大鼠检测病毒转染效率。在给予腺病毒注射处理4周后,将所有大鼠给予麻醉处理,行超声检测心功能后取材以备后续实验。3.心功能检测:将各组大鼠采用腹腔注射水合氯醛的方式（0.3mL/100g）进行麻醉后,用VEVO770成像系统检测各组大鼠的左室射血分数（LVEF）、左室收缩末期直径（LVESD）、左室舒张末期直径（LVEDD）及E/A比值等心功能指标。4.在实验期间定期测量大鼠的体重、心重、血糖、血压等数据。5.用HE染色观察心肌组织结构变化。6.用免疫组织化学染色观察心肌组织中NLRP3、半胱氨酸天冬氨酸酶-1（Caspase-1）、白介素1 beta（IL-1β）、白介素18（IL-18）等焦亡相关蛋白的表达以及Ⅰ型胶原（Collagen-Ⅰ）、Ⅲ型胶原（Collagen-Ⅲ）等纤维化蛋白的表达。7.用Masson染色试剂盒检测心肌组织中胶原纤维表达水平。8.提取原代心肌细胞:取0～3日龄Wistar大鼠心脏,冲洗、剪碎并用胶原酶Ⅱ消化后,取上清并离心,将沉淀用心肌细胞培养液悬浮。根据心肌细胞和成纤维细胞贴壁速度不同,将心肌细胞和成纤维细胞分离。将得到的心肌细胞接种到六孔培养板中进行后续实验。9.原代心肌细胞干预:首先,分为正常组（normal group,N组）、高渗组（hypertonic group,HP 组）、高糖组（high glucose,HG 组）,观察高糖刺激对 PRR 及 NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18的影响;其次,分为正常组（N组）、高糖组（HG组）、高糖+PRR过表达腺病毒组（Ad-PRR组）、高糖+空载体腺病毒对照组（Ad-EGFP组）。Ad-PRR组及Ad-EGFP组分别转染Ad-PRR、Ad-EGFP,并与高糖组一起给予高糖刺激,再观察PRR过表达对上述蛋白的影响;最后,分为高糖+PRR过表达腺病毒组（Ad-PRR组）、高糖+PRR过表达腺病毒+AMPK激动剂GSK621组（Ad-PRR+GSK621组）、高糖+空载体腺病毒对照组（Ad-EGFP组）、高糖+空载体腺病毒对照+AMPK激动剂GSK621组（Ad-EGFP+GSK621组）,各组分别转染Ad-PRR及Ad-EGFP后,给予高糖刺激及GSK621进行干预,观察PRR是否通过AMPK-NLRP3途径调控心肌细胞焦亡。10.采用实时荧光定量PCR（RT-PCR）检测心肌组织及心肌细胞中PRR、NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18 等的 mRNA水平。11.采用免疫印迹法（Western blot）检测心肌组织及心肌细胞中PRR、t-AMPK、p-AMPK、NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18 等分子的蛋白表达水平。12.应用酶联免疫吸附实验（ELISA）检测大鼠血清中及心肌细胞培养基中IL-1β、IL-18的含量。13.应用二氢乙啶（DHE）染色检测心肌细胞中活性氧（ROS）的水平。14.统计学分析:将数据用GraphPad 8.0软件进行处理,各组实验数据用平均数±标准差表示,并通过单因素方差分析的方法对多组数据进行相互比较。以P＜0.05为差异有统计学意义。研究结果1.在DCM心肌组织中PRR表达增加,NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18等焦亡蛋白分子表达增加,AMPK磷酸化水平降低,纤维化水平增加。过表达PRR后,上述焦亡相关蛋白表达明显增加,AMPK磷酸化水平明显下降,纤维化水平明显升高,从而加重DCM的心功能损伤。2.在高糖刺激下,原代心肌细胞中PRR表达增加,NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18等焦亡相关蛋白表达增加,AMPK磷酸化水平降低。过表达PRR后,ROS水平明显增加,AMPK磷酸化水平明显下降,上述焦亡相关蛋白表达明显增加,焦亡水平增加。3.在高糖刺激下,在PRR过表达基础上给予AMPK激动剂干预后,发现AMPK磷酸化水平升高,NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18等焦亡相关蛋白表达降低,焦亡水平降低,可逆转过表达PRR引起的焦亡水平增加。结论及意义在DCM中,高血糖刺激PRR表达升高,AMPK磷酸化降低,DCM心肌发生NLRP3介导的焦亡。过表达PRR可明显降低AMPK磷酸化,增加DCM心肌焦亡水平,增加纤维化水平,从而加重DCM心功能损伤。这表明PRR参与DCM心肌焦亡,并可能与DCM心肌中AMPK磷酸化水平降低、ROS水平升高、NLRP3过度激活有关。这可能为DCM的治疗提供新思路和靶点。