论文部分内容阅读
[目 的]1.通过small RNA测序筛选小细胞肺癌患者血浆中化疗耐药差异表达的microRNAs;2.在小细胞肺癌亲本细胞株H69及其多药耐药株H69AR中,对筛选出来的差异表达microRNAs进行实时定量PCR验证;3.预测差异表达显著microRNAs的靶基因,分析这些靶基因的功能及它们调控的关键信号通路。[方法]1.收集云南省肿瘤医院2017年7月-2018年12月经病理组织学确诊的未行手术且为首诊的小细胞肺癌同一患者首诊时及耐药时的血浆,通过small RNA测序筛选小细胞肺癌患者血浆中化疗耐药差异表达的microRNAs;2.分别提取小细胞肺癌亲本细胞株H69及其多药耐药株H69AR细胞的总RNA,运用 microRNA 反转录试剂盒(miRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit)将 RNA 反转录为cDNA,以U6为内参,通过实时定量PCR实验验证差异表达microRNAs的表达水平;3.运用TargetScanHuman 7.2、miRDB、miRTarbase等数据库预测差异表达显著的microRNAs的靶基因,再通过GO和KEGG数据库分析这些靶基因的功能及它们调控的关键信号通路。[结果]1.送出6例小细胞肺癌同一患者各自首诊时及耐药时的血浆样本共12份进行small RNA测序,6例患者确诊后均行依托泊苷(VP-16)联合铂类药物的一线化疗方案化疗,筛选出化疗耐药差异表达microRNAs的结果如下:A样本628个,B样本645个,C样本1200个,D样本2875个,E样本1089个,F样本3702个,6例样本化疗耐药共同差异表达的microRNAs有20个;2.经实时定量PCR验证,与小细胞肺癌亲本细胞株H69比较,miR-369-5p、miR-484、miR-584-5p和miR-1247-5p在其多药耐药细胞株H69AR中表达上调;miR-485-5p、miR-192-5p、miR-150-5p、miR-3529-3p、miR-4446-3p、miR-363-3p、miR-320e、miR-3184-3p、miR-378a-3p、miR-625-5p、miR-375-3p、miR-4488、miR-615-3p和miR-92a-5p在其多药耐药细胞株H69AR中表达下调;miR-6842-3p和miR-423-5p在其多药耐药细胞株H69AR中无明显变化。3.挑选出显著差异表达的 miR-369-5p、miR-584-5p、miR-485-5p、miR-192-5p、miR-150-5p、miR-3529-3p、miR-4446-3p、miR-3184-3p、miR-615-3P、miR-378-3p和miR-484,利用TargetScanHuman 7.2软件预测其靶基因,再通过GO和KEGG数据库分析这些靶基因的功能及它们调控的关键信号通路,发现这些靶基因主要参与基因转录、细胞周期、细胞生长、细胞死亡和细胞间信号转导等重要的生物学过程,发挥催化活性、蛋白结合转录因子活化、核酸结合转录因子活性等生物学功能。KEGG PATHWAY显著性富集得到两条在小细胞肺癌中较有意义的信号通路途径:PI3K-AKt signaling pathway 和 Notch signaling pathway。[结 论]1.通过对6例小细胞肺癌同一患者各自首诊时及耐药时的血浆样本进行small RNA测序,得到6例样本化疗耐药共同差异表达的microRNAs有20个;2.在小细胞肺癌细胞株中通过实时定量PCR验证得到,与亲本细胞H69相比,有4个microRNAs在其多药耐药细胞株H69AR中表达上调;有1 4个microRNAs在其多药耐药细胞株H69AR中表达下调;有2个microRNAs在其多药耐药细胞株H69AR中无明显变化;3.通过GO数据库对差异显著microRNAs的靶基因进行分析,发现这些靶基因主要参与基因转录、细胞周期、细胞生长、细胞死亡和细胞间信号转导等重要的生物学过程,发挥催化活性、蛋白结合转录因子活化、核酸结合转录因子活性等生物学功能;通过KEGG PATHWAY显著性富集分析得到两条在小细胞肺癌中较有意义的信号通路途径:PI3K-AKt signaling pathway 和 Notch signaling pathway。