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前言:WNK[With-no-lysine(K)kinase]是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,包括WNK1-4。该激酶家族成员的特点是其催化结构域第二亚区中保守的具有锚定ATPα和β磷酸基团作用的赖氨酸位点被半胱氨酸替代,赖氨酸则位于第一亚区,但是激酶的生物活性并没有发生改变。目前,对WNK4激酶的功能研究表明WNK4在电解质平衡和血压调节方面扮演着重要角色。可见,研究WNK4基因表达调控机制,不仅能阐明高血压发生的某种机理,也为开发治疗高血压新药提供线索和目标。我们研究组成员前期通过RT-PCR检测发现包括雌激素、糖皮质激素在内的几种激素可以下调人类WNK4(hWNK4)基因的表达;并且通过一系列实验验证了糖皮质激素通过位于hWNK4启动子区域的糖皮质激素反应元件负性调节该基因的表达,为阐明糖皮质激素作为药物应用产生的副作用(如钠水储留、碱中毒和高血压等)提供依据。由于雌激素是生殖系统、心血管系统和脑、骨骼等器官生长、发育和功能维持的重要调节子,因此有必要进一步探索雌激素下调WNK4基因表达的具体机制。本研究以17β-雌二醇(E2)为刺激因素,探讨雌激素对hWNK4基因表达的影响及其作用机制。
材料与方法:
一、实验材料
1、人胚肾HEK293细胞系;
2、刺激药物:E2、ICI182,780、放线菌素D(actinomycin-D)和放线菌酮(cycloheximide);
3、RNA提取相关试剂、RT试剂盒及Real-time PCR相关试剂;
4、人类c-Jun、c-Fos表达载体和人类雌激素受体alpha(Erα)表达载体;
5、基因重组及萤光素酶报告基因检测相关试剂及试剂盒;
6、DNA-蛋白质结合实验、免疫共沉淀(co-IP)、电泳泳动迁移实验(EMSA)及染色质免疫沉淀(ChIP)相关试剂;
7、Western blot相关试剂。
二、实验方法
1、Real-time PCR检测E2等药物刺激前后hWNK4 mRNA表达水平的变化;
2、利用生物信息学软件分析hWNK4基因启动子结构,构建hWNK4启动子序列系列截短的萤光素酶报告基因重组体,应用双荧光素酶活性检测系统检测启动子的活性以及E2对hWNK4启动子活性的影响,鉴定hWNK4启动子关键的转录调控区和雌激素反应区;
3、EMSA和ChIP实验鉴定hWNK4启动子内activator protein-1(AP-1)反应元件;
4、应用双荧光素酶活性检测系统检测转录因子AP-1过表达对hWNK4启动子活性的影响;
5、应用DNA-蛋白质结合实验和ChIP实验鉴定AP-1反应元件的DNA-蛋白质复合物组成以及检测E2对c-Jun、c-Fos和Era蛋白与AP-1元件结合力的影响;
6、通过免疫共沉淀和re-ChIP方法鉴定结合于AP-1反应元件的各转录因子之间的相互作用;
7、应用双荧光素酶活性检测系统和Real-time PCR方法检测AP-1和Erα共同作用对hWNK4转录的调节;
8、Western blot检测E2对转录因子AP-1蛋白表达水平的影响。
结果:
1、Real-time PCR结果表明E2/Erα以浓度依赖的方式下调hWNK4 mRNA的表达水平;并且雌激素受体抑制剂ICI182,780和转录抑制剂actinomycin-D可分别抑制这种下调,而蛋白合成抑制剂cycloheximide则否;
2、ALiBaba2.1和TRANSFAC TESS软件预测分析结果显示hWNK4启动子区域有多个转录因子结合元件,包括GR、GATA-1、AP-1、SP-1等,但是没有ERE;
3、hWNK4基因启动子的-216～-202区域是该基因关键的转录调控区和雌激素反应区;
4、EMSA和ChIP实验分别在体外和体内条件下证明了hWNK4启动子-216～-202区存在AP-1反应元件;
5、通过共转染转录因子AP-1和hWNK4启动子-luc载体,萤光素酶活性检测发现AP-1可以上调hWNK4启动子的转录活性;
6、DNA-蛋白质结合实验和ChIP实验结果显示E2/Erα可使c-Fos、c-Jun和Erα与hWNK4启动子AP-1反应元件的结合增强;
7、免疫共沉淀结合Western blot实验和re-ChIP实验共同验证了c-Jun和Erα之间存在直接的相互作用;
8、萤光素酶活性检测发现c-Fos/c-Jun过表达显著增加p216-luc的活性,而E2/ERα则抑制这种活性的增加;同样,Real-time PCR的结果也显示E2/Erα能下调c-Fos/c-Jun诱导的hWNK4基因转录;
9、Western blot实验结果提示E2刺激可上调转录因子AP-1蛋白表达,并且ERα过表达会增强这种上调作用。
结论:
1、E2刺激可以下调hWNK4基因mRNA表达水平;
2、hWNK4基因启动子-216～-202区域存在AP-1反应元件;
3、AP-1反应元件对hWNK4启动子的基础转录活性起关键作用并介导E2对hWNK4基因转录的抑制;
4、结合于hWNK4启动子AP-1反应元件的DNA-蛋白质复合物包括c-Jun、c-Fos和ERα,其中c-Jun和c-Fos直接结合DNA,ERα通过与c-Jun相互作用的方式间接结合DNA,E2/ERα增强了c-Jun、c-Fos和ERα与AP-1反应元件的结合,这是E2/ERα使hWNK4基因mRNA表达下调的可能机制。