论文部分内容阅读
恶性肿瘤严重威胁着人类的生命与健康,是造成死亡的十大原因之一。肝癌是最常见的恶性肿瘤之一,而亚洲和非洲是肝癌的高发区,且发病率呈逐年上升趋势。据报道,肝癌患者的术后5年复发率达60%以上,其高复发率和转移是导致肝癌患者术后死亡的主要原因。中药是祖国医学的瑰宝,已有研究发现中药石斛的主要来源植物铁皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）和紫皮石斛（D.devonianum Paxt.）加工的药材具有抗肿瘤作用,由于药材形态相似,这两种石斛在临床上应用时常易混淆,而目前有关它们的抗肿瘤活性比较还鲜有报道,其抗肿瘤活性物质基础也尚未阐明。目的:本论文通过体外细胞实验,比较铁皮石斛和紫皮石斛各种提取物及其单体化合物的抗肿瘤活性,发现活性物质;并进一步以活性成分毛兰素（Erianin）为研究对象,探讨其抑制肝癌细胞转移的活性及机制。方法:1.采用加热回流和液液萃取等方法提取制备铁皮石斛和紫皮石斛各种提取物。2.采用3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴盐实验（3-（4,5-dimethyl-thiazol-2-yl）-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT）对各石斛提取物（100 mg/L）以及单体成分（0～50μM）进行抗肿瘤活性的筛选,比较铁皮石斛和紫皮石斛的抗肿瘤活性,发现抗肿瘤活性成分,采用高效液相色谱法对两种石斛的活性石油醚和乙酸乙酯部位进行初步分析。3.通过划痕实验、细胞小室迁移实验、细胞小室侵袭实验检测Erianin（0.03 n M,0.3 n M,3 n M）的抗肝癌转移活性。4.将Erianin（0.3 n M,3 n M）与肝癌细胞孵育24 h后,检测Erianin对肝癌细胞内糖摄取量、乳酸产量的影响;对肝癌细胞内烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH）含量、NADPH/NADP+的影响。采用实时荧光定量PCR（Real-time polymerase chain reaction,Real-time PCR）检测Erianin对肝癌细胞糖代谢关键酶磷酸果糖激酶1（Phosphofructokinase l,PFK1）、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（Glucose6-phosphatedehydrogenase,G6PDH）、肌肉型丙酮酸激酶（Pyruvate kinase M,PKM）、6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶（6-phosphogluconate dehydrogenase,6PGD）、6-磷酸果糖酰胺转移酶（Glutamine fructose-6-phosphate amidotransferase,GFAT）基因表达的影响。采用蛋白质免疫印迹法（Western-blot）实验检测Erianin对肝癌细胞6PGD酶蛋白表达的影响,并检测Erianin对肝癌细胞6PGD酶活力的影响。采用活性氧（Reactive oxygen species,ROS）形成实验检测Erianin对肝癌细胞ROS含量的影响。5.将Erianin（0.3 n M,3 n M）与肝癌细胞孵育24 h后,采用Real-time PCR检测Erianin对肝癌细胞中转录因子Snail（Transcriptional factor Snail,Snail）基因表达的影响,采用Western-blot检测Erianin对肝癌细胞中与上皮-间质转化（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）相关蛋白表达的影响,探寻EMT在Erianin抑制肝癌转移中的作用。结果:1.铁皮石斛和紫皮石斛的各种提取物（粗多糖、95%乙醇部位、石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位）得率接近。2.铁皮石斛、紫皮石斛的石油醚部位和乙酸乙酯部位对多种肿瘤细胞的生长都有明显的抑制作用,且铁皮石斛的抗肿瘤作用强于紫皮石斛;铁皮石斛、紫皮石斛的活性石油醚部位和乙酸乙酯部位共有19个共有峰,主要富集了联苄类和黄酮类成分;3,4’-二羟基-5-甲氧基联苄（3,4’-dihydroxy-5-methoxybibenzyl,DMB）、夏佛塔苷（Schaftoside）、异夏佛塔苷（Isoschaftoside）对肿瘤细胞无明显抑制作用,毛兰素（Erianin）和杓唇石斛素（Moscatilin）对多种肿瘤细胞都有抑制作用,对肝癌细胞最为敏感,且Erianin的抗肿瘤作用强于Moscatilin。3.Erianin（0.3 n M,3 n M）可以减少肝癌细胞Hep3B、MHCC97H、HCCLM3的爬行距离和细胞小室实验的穿膜细胞个数,抑制肝癌细胞的迁移和侵袭。4.与低迁移肝癌细胞SMCC7721相比,高迁移肝癌细胞Hep3B、MHCC97H、HCCLM3的糖摄取量明显升高,乳酸产量明显升高,NADPH含量、NADPH/NADP+明显升高,酶GFAT的基因表达、酶6PGD的基因和蛋白表达明显升高,6PGD酶活力明显上升,ROS含量也明显升高。Erianin可降低高迁移肝癌细胞Hep3B、MHCC97H、HCCLM3内升高的糖摄取量、乳酸产生量、NADPH含量、NADPH/NADP+比值、酶GFAT的基因表达、酶6PGD的基因与蛋白表达、6PGD酶的活力,并升高ROS的含量。肝癌细胞HCCLM3中酶PFK1、PKM、G6PDH的基因表达无明显变化。5.与低迁移肝癌细胞SMCC7721相比,高迁移肝癌细胞HCCLM3和MHCC97H中成纤维细胞特异蛋白-1（Fibroblast-specific protein 1,FSP1）和α-平滑肌肌动蛋白（Smooth muscle aorta,α-SMA）的表达明显增加,E钙粘蛋白(E-Ca2+dependent cell adhesion molecules,E-Cadherin)和紧密连接蛋白1（Recombinant tight junction protein 1,Claudin-1）的表达明显减少,Erianin可减少升高的α-SMA、FSP1的蛋白表达,增加减少的E-Cadherin、Claudin-1蛋白表达。与低迁移肝癌细胞SMCC7721相比,高迁移肝癌细胞Hep3B、HCCLM3和MHCC97H中转录因子Snail（Transcriptional factor snail,Snail）的基因和蛋白表达都明显增加,Erianin可减少升高的转录因子Snail的基因和蛋白表达。结论:1.铁皮石斛和紫皮石斛的石油醚部位和乙酸乙酯部位对多种肿瘤细胞生长均有不同程度的抑制作用,且铁皮石斛的抗肿瘤活性强于紫皮石斛。对石油醚部位、乙酸乙酯部位中含有的联苄类和黄酮类成分进行抗肿瘤活性筛选后,发现Erianin具有强效且广泛的抗肿瘤活性,且对肝癌细胞非常敏感,能抑制肝癌细胞转移。2.以Erianin为研究对象,发现其抑制肝癌转移的机制可能是:Erianin可以抑制糖摄取,减少6PGD酶的基因和蛋白表达,降低6PGD酶的活力,抑制戊糖磷酸途径,减少NADPH的生成,导致ROS的消耗减少,ROS含量增加;也可以降低肝癌细胞内Snail的基因和蛋白表达,抑制EMT的发生,最终抑制肝癌细胞的转移。