目的:以补骨脂为研究对象,围绕补骨脂中化合物的雌激素样作用,采用多种细胞模型和分子生物学手段开展实验研究,并运用计算机模拟分子对接技术分析化合物与雌激素受体的结合亲和性,探讨补骨脂中具雌激素样作用化合物的作用机制。方法:1.采用CCK8试剂盒检测补骨脂75%乙醇提取物及其石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、水四个萃取部位以及补骨脂中13个化合物对MCF-7细胞活力的影响;采用稳定转染ERα/β-ERE荧光素酶报告基因的HEK293细胞,测定荧光素酶的表达,比较补骨脂提取物、化合物与ER受体亚型的亲和力与选择性。2.采用计算机模拟验证,将补骨脂中13个化合物与相应的雌激素受体ERα和ERβ进行分子对接,并进行相关的构效分析,总结补骨脂中化合物的结构特点与雌激素样作用强弱的关系。3.采用碱性磷酸酶ALP试剂盒对13个化合物的促成骨细胞分化作用进行检测。采用实时定量荧光PCR法检测5个活性化合物对雌激素通路的相关基因ERα、ERβ、p S2及骨分化通路的相关基因β-catenin、c-myc、cyclin E1、CDK2、CDK4表达的影响。采用蛋白质免疫印迹法检测5个活性化合物对雌激素通路和骨分化通路的相关蛋白ERα、ERβ和β-catenin的表达的影响。结果:1.对补骨脂75%乙醇提取物的雌激素样活性测定结果显示,75%乙醇提取物在浓度为0.1 mg生药/ml到1 mg生药/ml时能够显著促进人乳腺癌细胞MCF-7的生长,在浓度为0.05 mg/ml到1 mg/ml时能够显著激动雌激素受体ERα和ERβ,表明其有较强的雌激素样作用。2.对补骨脂75%乙醇提取物的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、水四个萃取部位的雌激素样活性测定结果显示,在四个萃取部位中,乙酸乙酯萃取物是雌激素样活性最强的部位。乙酸乙酯萃取物中的化合物可大致分为四类,查尔酮、二氢黄酮、异黄酮和拟雌内脂类,从中选取13个化合物补骨脂查尔酮（BCL）、异补骨脂查尔酮（IBCL）、补骨脂色烯查尔酮（BCM）、异补骨脂色烯查尔酮（IBCM）、Brosimacutin G（BG）、补骨脂二氢黄酮（BVC）、补骨脂二氢黄酮甲醚（BVCN）、染料木黄酮（GT）、corylifol A（CA）、新补骨脂异黄酮（NBIF）、补骨脂定（PD）进行后续实验。3.13个化合物的雌激素样活性测定结果表明,异黄酮的雌激素样作用在四个类别中是最强的。化合物BCL、IBCL、IBCM、BG、BVCN、GT、CA、NBIF、PD在不同的浓度上都有促进MCF-7细胞增殖的作用。通过ERE-荧光素酶报告基因检测,这13个化合物都能够在不同的药物浓度作用下激动ERα和ERβ受体,并且部分化合物的激动作用受雌激素通路的专属抑制剂ICI 182,780的阻断。4.将上述13个化合物与雌激素受体ERα和ERβ进行计算机分子模拟对接,对化合物与受体之间的结合能力进行打分,分析结果与细胞实验结果一致。构效分析结果表明,羟基的位置、数量,是否脱水成环,碳链长短等与雌激素样作用的强弱有较大关系。5.对13个化合物在MG-63细胞中ALP活力测定结果显示,化合物BCL、IBCL、BCM、BG、GT、NBIF、PD、CLD在不同的浓度下,均能使ALP活性显著增强。6.实时定量荧光PCR实验结果显示,在MCF-7细胞中,化合物IBCL、BCM、BVC、NBIF、PD可以显著促进雌激素受体ERα和ERβ的基因表达,除BCM外,其余四个化合物均可以显著促进雌激素受体p S2的基因表达。在MG-63细胞中,上述五个化合物均能够显著促进ERα的基因表达,化合物IBCL、BCM、NBIF、PD可以显著促进ERβ的基因表达,化合物IBCL、BCM、NBIF可以显著促进p S2、β-catenin、c-myc、cyclin E1、CDK2的基因表达。蛋白质免疫印迹法实验结果显示,化合物IBCL、BCM、BVC、NBIF、PD可以显著增强MG-63细胞雌激素受体ERα的蛋白表达,除BVC外,均可以促进雌激素受体ERβ的蛋白表达,IBCL、BCM、NBIF可以在不同的浓度下促进β-catenin的蛋白表达。结论:MCF-7细胞增殖实验和ERE-荧光素酶报告基因表达实验均表明,补骨脂的75%乙醇提取物有较强的雌激素样作用,其石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、水四个萃取部位中,以乙酸乙酯部位的雌激素样作用最强。对从补骨脂乙酸乙酯部位选取的13个化合物的雌激素样作用进行研究,结果表明,异黄酮类化合物的雌激素样活性最强;13个化合物都能够在不同的浓度下激动ERα和ERβ受体,并且部分化合物的激动作用受专属抑制剂ICI182,780的阻断,有显著的抑制趋势,提示可能通过雌激素经典通路ER通路发挥作用;而部分化合物的作用则不受抑制剂ICI182,780阻断,提示其发挥雌激素样作用的通路可能不止ER通路一条。同时,结合计算机分子对接的打分结果,对13个化合物的构效关系进行分析,发现化合物结构中羟基的位置、数量,环的数量以及碳链长短等与其所表现出来的雌激素样作用强弱有一定的相关性。MG-63细胞ALP活力测定及QPCR和WB实验结果表明,IBCL、BCM、NBIF等化合物具有促进成骨细胞分化的作用,其通路可能与Wnt-β-Catinin通路有关。化合物发挥作用的机制可能是先激活雌激素经典通路ER通路,再作用于β-catenin蛋白以及下游的相关基因,从而起到促成骨细胞分化的作用。