浒苔(Ulva prolifera)具有复杂的生活史和多样的繁殖方式,加上漂浮浒苔利于漂浮的中空管状结构,让浒苔能更好得应对自然界的胁迫,使浒苔成为绿潮优势种之一。目前关于自然界胁迫对浒苔生长繁殖的影响,主要集中在温度、光照和盐度上。对营养元素胁迫研究的较少,氮素作为限制浒苔生长的关键营养元素,对浒苔的生长起着决定性作用,有较大的研究意义。但目前的研究中,一方面对氮元素的影响仅停留于在海水的原有基础上加硝态氮或者铵态氮,即对海水中氮浓度的控制不准确,另一方面研究仅限于对生长量等生理指标的检测,没有深入到分子层面。本实验旨在补充氮胁迫对浒苔生理代谢的影响,并从分子层面研究浒苔对氮胁迫应答的分子机制。本文以漂浮浒苔作为研究对象,首先补充了漂浮浒苔氮同化关键酶基因的扩增。氮同化过程就是指植物吸收外界环境中的硝态氮和铵态氮,转化成氨基酸和蛋白质等含氮化合物的过程。硝酸盐同化涉及到硝酸还原酶(NR)、亚硝酸还原酶(NiR)、谷氨酰胺合成酶(GS)和谷氨酸合成酶(GOGAT)这4个关键酶,其中浒苔NR已有报道全长序列。本实验根据实验室转录组数据,首次在浒苔中扩增出GS1的cDNA全长序列1143bp,GenBank登录号为:MN496139;扩增出Fd-NiR的cDNA全长1698bp,GenBank登录号为:MN496140;扩增出Fd-GOGAT的部分CDS区长度为2627bp,GenBank登录号为:MN496141;并进行蛋白质理化性质和三维结构等预测分析。补充了浒苔在氮同化关键酶基因克隆上的空缺,为后续进行氮胁迫/氮富集条件下氮同化关键酶表达调控的研究做准备。根据前期实验获得的氮同化关键酶序列设计引物进行qRT-PCR实验,同时检测浒苔生长量和叶绿体含量变化,以研究各在氮胁迫条件下浒苔生长状态和氮同化关键酶的表达情况。研究发现在氮剥夺情况下会导致浒苔的生长相对速率和叶绿素含量下降,但在短期内依旧稳定生长。其氮同化关键酶也在一定的平稳表达后出现小幅度增加,结合文献可推测浒苔在短期内利用了储藏的色素和蛋白质作为内在氮源,满足缺氮时基本的生理代谢需求,以渡过氮缺乏时期。为研究MAPK信号通路在浒苔应对氮胁迫时的作用,实验选用了 SB239063抑制剂对p38MAPKα/β进行抑制,观察浒苔原生质体在死亡率和细胞壁再生情况。通过原生质体培养液成分调整,实验发现氮富集条件下提高了浒苔原生质体的存活率和细胞壁再生速度,缺氮环境反之。又通过Western Blotting检测氮胁迫下MAPK磷酸化水平,发现氮剥夺能诱导MAPK的磷酸化,且随时间延长磷酸化水平升高。再通过Western Blotting检测SB239063抑制剂对MAPK磷酸化的抑制情况,发现在10μM抑制剂SB239063处理下,MAPK磷酸化水平下降显著确定了抑制剂作用浓度。利用SB239063对原生质体抑制后死亡率和细胞壁再生的结果,可以推测出MAPK在氮剥夺的情况下通过磷酸化响应调控下游因子,降低了原生质体的死亡率和再生率,减缓细胞的生理生化过程,减少消耗度过不利环境。解释浒苔在缺氮时的海上仍不会发生藻体死亡,并继续增殖的原因。本实验为MAPK信号通路在浒苔应对非生物胁迫的作用上进行了尝试,为后期进一步研究浒苔中信号通路响应不利环境的作用机理做了铺垫。