糖类在多种生物学过程中扮演着重要角色。细菌蛋白质上的聚糖参与介导病原体--宿主的相互作用,在细菌粘附,免疫逃逸和宿主定殖等生物过程中发挥着关键作用。人体中细胞表面糖基化的改变与一些免疫性疾病和肿瘤的发生发展过程密切相关。通过提取分离以及化学-酶法合成制备更多的功能性寡糖、多糖和糖缀合物,有助于开发新的糖类药物用于疾病的诊断和治疗。细菌表面覆盖着结构丰富多样的多糖,研究这些多糖以及参与糖基化过程的酶类有助于开发出更多的功能性多糖和糖基转移酶。因此,本论文对微生物的胞外多糖和糖基转移酶进行了研究。具体来说共分为三个部分:第一部分是四川泡菜中枯草芽孢杆菌胞外多糖的分离鉴定和抗氧化活性研究;第二部分是探讨了一种新型N-糖基转移酶AaNGT的酶学性质并合成了糖肽和氨基寡糖衍生物;第三部分是在此基础上,运用AaNGTQ468G制备了多功能转铁蛋白纳米载药系统并对HepG2抗肿瘤活性进行了初步探究。第一部分:从自然界提取活性多糖成为人们开发天然药品和保健品的一个重要途径。由于胞外多糖容易生产,理化性质独特等优点使其在食品和医药工业中备受关注。但是很多胞外多糖来源于病原微生物,具有致病风险,因此亟待开发安全性高的胞外多糖。四川泡菜是我国发酵蔬菜的杰出代表,含有丰富的微生物资源,包括芽孢杆菌和乳酸菌。目前芽孢杆菌胞外多糖作为生物絮凝剂、生物乳化剂、重金属螯合剂、抗病毒免疫调节剂等具有良好的理化和生物学特性。然而对氧化应激保护作用的研究较少,故本部分对泡菜来源的枯草芽孢杆菌胞外多糖进行了初步抗氧化活性研究。具体来说,通过对四川泡菜菌种筛选、分离和培养得到了一株高产胞外多糖菌株。经16S rDNA测序和聚类分析该菌株鉴定为枯草芽孢杆菌。从其发酵液中提取胞外多糖并进行逐级分离纯化,得到BS-1和BS-2两个组分,其中BS-2分子量为1.765×104Da含量较高。对其进行单糖组分分析、甲基化分析、红外光谱和核磁波谱分析等结构表征,表明BS-2的组分含甘露糖、葡萄糖和半乳糖,糖链的主链结构为（1→4）-Glc,（1→4）-Gal和（1→4,6）-Glcp,半乳糖残基为端基糖存在于糖链中,可能有少量甘露糖存在于支链中。抗氧化结果表明BS-2对自由基具有一定的清除活性,能降低H2O2氧化损伤引起的RAW264.7细胞的凋亡,减弱氧化损伤对细胞的损伤。通过本部分的研究,从四川泡菜的枯草芽杆菌中分离到一种具有较高抗氧化能力的新型EPS,为开发食品级胞外多糖添加剂和微生物多糖的开发利用提供了新的思路。第二部分:微生物的糖基转移酶的不仅可以调控微生物多糖的合成,还能参与蛋白的糖基化影响宿主-微生物的相互作用。最新研究发现一种来源于流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae）中的新型N-糖基转移酶（HWM1C）能将胞质中游离的UDP-Glc或UDP-Gal直接添加在肽链的Asn残基上。这与传统PglB所介导的N-连接的糖基化途径有所不同,为蛋白质的糖基化修饰提供了一种新的途径。研究表明来源于胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacilluspleuropneumoniae）的N-糖基转移酶（ApNGT）活性口袋处的Gln469是影响酶催化活性的关键位点。我们对来源于嗜血嗜沫杆菌（Aggregatibacteraphrophilus）与ApNGT高度同源的N-糖基转移酶AaNGT进行了酶学性质研究。对SWISS-MODEL同源模型中与ApNGT活性口袋处相同的催化位点Gln468进行定点突变为空间位阻更小的甘氨酸和丙氨酸。研究结果表明,AaNGT的反应无需金属离子催化,最适的反应缓冲液为pH 8.0 的 PBS,最适反应温度为 30℃。AaNGT 对 UDP-Glc、UDP-Gal 以及UDP-GlcN的反应效率分别为100%、78%和55%。不能识别四位叠氮和甲基化修饰的糖、二位脱氧和氟代的糖,也不能识别二位基团比NH2-体积更大的糖衍生物,如UDP-GlcNA和UDP-GlcNPr。相对于野生型的AaNGT,其突变酶AaNGTQ468G和AaNGTQ468A对UDP-GlcN的催化效率均没有显著提高。反应6 h后AaNGTQ468G对UDP-Gal催化效率为93%,显著高于AaNGT和AaNGTQ468A。根据AaNGT能够催化UDP-GlcN分子与多肽序列上糖基化位点Asn共价偶联的性质。我们提出了一种三步合成N-糖肽的简单方法。首先AaNGT将活化的GlcN（UDP-GlcN）转移到多肽的Asn残基上,然后利用一种来自丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum）的葡糖胺-N-乙酰转移酶（GlmA）将多肽上的GlcN乙酰化为GlcNAc,形成GlcNAc连接的多肽;最后利用冻土毛霉（Mucor hiemalis）糖苷内切酶突变体EndoMN175Q将N-聚糖恶唑啉转移到GlcNAc连接的多肽上形成N-聚糖结构的糖肽。这为制备结构均一糖肽和糖蛋白提供了新的思路。另外基于氨基NH2-和HO-类似的电子半径和极性,探究了不同半乳糖基转移酶LgtB,LgtC和α1,3 GalT对UDP-GalN的识别作用,合成了一系列氨基寡糖衍生物,为扩展化学酶法合成寡糖模拟物提供了新的方法。第三部分:基于突变酶AaNGTQ468G能以较高的效率对DANYTK短肽进行半乳糖化的特点。本部分选取了生物相容性好,具有自组装功能的人源重链转铁蛋白（Human Ferritin Heavy Chain,HFn）进行基因工程改造使其C端带有DANYTK序列和RGDS（Arg-Gly-Asp-Ser）靶向肽,并用AaNGTQ468G进行半乳糖基化修饰,得到RGDS/Gal-HFn纳米载体蛋白。去唾液酸糖蛋白受体（Asialoglycoprotein receptor,ASGPR）广泛存在肝癌细胞表面,半乳糖基化的HFn可与ASGPR结合进而实现对肝的靶向性,RGDS可通过与肝癌细胞表面整合素受体αvβ3作用实现HFn的双重靶向。肝靶向给药系统能有效将药物运输到病灶部位,提高疗效、降低毒副作用等减少药物的不良反应。2-氟-L-岩藻糖（2-fluoro-L-fucose,2FF）是L-岩藻糖的特异性氟化类似物,已经被报道具有抗肿瘤活性,对于其作用机制有待进一步的探究。因此我们根据不同pH条件下RGDS/Gal-HFn能自组装的特性,将2FF进行包裹,构建了具有肝靶向性的RGDS/Gal-HFn/2FF纳米载药系统。以人肝癌细胞（HepG2 Cells）为体外模型,初步探讨了纳米载药系统对肿瘤细胞的作用机制。结果表明该纳米载药系统对HepG2的增殖和迁移有显著的抑制作用。此外,该纳米药物系统能明显减低HepG2表面的岩藻糖基化水平。RT-PCR结果表明能显著降低免疫抑制因子TGF-β、IL-2、IL-10、和VEGF的mRNA表达水平。Western blot结果显示该药物系统能显著降低p-Akt和p-ERK蛋白的表达。该药物系统与HepG2细胞和未成熟树突状细胞（DC,dentric cell）共孵育后能显著促进DC的成熟程度。将该纳米载药系统进行小鼠活体实验,结果表明其对肝癌模型小鼠肿瘤生长有明显的抑制作用,HE染色表明肿瘤组织出现异常变化,心肝脾肺肾部位组织并没有明显变化。通过修饰Cy5.5荧光分子,能实现对小鼠肿瘤部位的靶向成像。流式细胞术分析结果表明,该药物系统能显著提高小鼠中CD8+淋巴细胞/Treg细胞的比例和血液中IL-12p40、IFN-γ和TNF-α细胞因子的表达水平。本部分的研究结果表明,RGDS/Gal-HFn/2FF能提高肿瘤模型小鼠的免疫力并且发挥较好的抗肿瘤活性。通过修饰荧光分子还能进行肿瘤的靶向成像。在肿瘤的诊断和治疗中具有一定的实用价值。总之,本论文对四川泡菜中枯草芽孢杆菌的胞外多糖进行了提取分离和抗氧化活性测定。同时我们探讨了一种新型N-糖基转移酶AaNGT对不同UDP-Sugar底物的特异性,基于AaNGT对UDP-GalN的识别作用,开发了一种简易的化学酶法制备均一结构N-糖肽的新方法。根据不同半乳糖基转移酶对UDP-GalN的识别作用合成了一系列的氨基寡糖衍生物,为糖肽、寡糖片段及其衍生物的合成建立了新的方法。另外基于AaNGTQ468G酶对UDP-Gal的识别作用,构建了对肝靶向的纳米载药系统RGDS/Gal-HFn/2FF,为靶向载药系统在癌症治疗和诊断中的应用提供了新的科学依据与方法。以上研究成果为微生物胞外多糖和糖基转移酶的开发利用提供了新的思路。