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肺结核(Tuberculosis, TB)是对人类健康有严重危害的疾病,是全世界第二大致命的传染病,由结核分枝杆菌感染导致的呼吸系统的疾病。痰内MTB的检测是现今临床上诊断肺结核的金标准,但由于MTB在体内多以休眠状态存在,培养时间长,应用受到限制,从而延误TB的诊断和治疗。复苏促进因子(resuscitation promoting factor,Rpf)1998年首先被发现于藤黄微球菌的培养液中,促进其它高G+C含量革兰氏阳性菌(如藤黄微球菌,海分枝杆菌和MTB)的复苏和生长。后来陆续发现了其他的一些复苏促进因子如：Rv0867c(Rpf A)、Rv1009c (RpfB)、Rv1884c (RpfC)、Rv2389c (RpfD)和PRv2450c (RpfE),它们既与细菌增殖有关,也可能是宿主免疫识别的靶抗原。复苏因子结合蛋白A(resuscitation promoting factor interacting protein A, Rip A)是能与RpfB结合的伴侣蛋白分子,是一种肽聚糖水解酶,能协同rpfB促进休眠的MTB复苏。序列比对发现MTB中存在一个与Rip A N端结构高度同源,分子量略小的蛋白(RipB),推测它可能具有降解革兰氏阳性菌细胞壁的肽聚糖的功能,也能够促进休眠细菌进入复苏状态。在本研究中,我们将在大肠杆菌中表达并纯化RpfE和RipB蛋白,研究它们刺激细菌增殖功能,评价其作为快速培养检验MTB候选组分的可能性。论文分三个部分：1、MTB RpfE表达质粒的构建,蛋白表达与纯化根据rpfE的基因序列,设计了目标基因的引物,以肺结核分枝杆菌的全基因为模板,扩增出rpfE的基因,构建了pGEX-4T-rpfE的质粒,重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3),通过IPTG诱导表达,37℃表达目标蛋白占菌体蛋白总量的40%,并且目标蛋白主要以包涵体的形式存在。RpfE的最佳表达条件为28℃,IPTG的终浓度为0.75mmol/L,诱导表达10个小时。2、MTB Rip B表达质粒的构建,蛋白表达与纯化根据RipB的基因序列,设计了目标基因的引物,以肺结核分枝杆菌的全基因为模板,扩增出RipB的基因,构建了pET-21a-RipB的质粒,重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3),通过IPTG诱导表达,37℃表达目标蛋白占菌体蛋白总量的35%。RipB蛋白的最佳表达条件为15℃, IPTG的终浓度为0.2mmol/L,诱导表达12个小时。3、RpfE与RipB蛋白的促细胞增殖效果分析两种目标蛋白分别进行不同浓度蛋白对藤黄微球菌的复苏和促生长作用效果的检测,发现两种蛋白在100pmol/L的浓度显著促进细胞增殖。