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研究背景与目的肿瘤的免疫治疗是近几年的研究热点。通过重新激活机体的抗肿瘤免疫,识别并杀伤肿瘤细胞,极大提高了部分病人的长期生存率。溶瘤病毒作为免疫治疗的一种方式,也受到众多关注。溶瘤病毒具有杀伤肿瘤细胞与激活免疫的双重作用,具有不可比拟的优势。但在大规模临床应用之前,其安全性与有效性仍有待进一步提高。在此研究中,我们提出了一种设计新型溶瘤病毒的思路:在不影响病毒复制能力的前提下,选择性突变病毒基因组内行使免疫抑制功能的核酸。这种设计将使病毒丧失抑制细胞免疫激活的能力,以达到同时增强溶瘤病毒的靶向性和有效性的目的。在此,我们集中关注了干扰素系统。干扰素系统不仅是固有免疫的重要组成,更是桥接固有免疫与适应性免疫的桥梁。肿瘤局部的干扰素表达可有效促进抗肿瘤免疫的激活。因此,我们希望开发一种新型的溶瘤病毒,可在体内安全使用,选择性靶向肿瘤组织,并有效的激活肿瘤微环境内干扰素的上调。研究方法与结果为系统性评估病毒中免疫抑制的位点,我们首创了一种结合高通量方法学、正向遗传学与反向遗传学的系统生物学方法,可同步研究所有病毒基因组中所有单核苷酸突变的表型。以流感病毒为例,我们构建了覆盖甲型流感病毒全基因组单核苷酸突变文库。并系统性筛选了其干扰素敏感的位点。除了已知的NS1蛋白外,我们发现并验证了分布于PB2、PB1、PA、M1等多个病毒蛋白的近30种不同的干扰素敏感突变。为增强突变株干扰素敏感及干扰素诱导的表型,我们合并了 8个可上调干扰素表达的突变位点,构建了高干扰素敏感的多点突变病毒株(Hyper Interferon Sensitive,HIS)。HIS在多种原代及永生化细胞中均可显著上调干扰素反应。在体内实验中,HIS在正常小鼠肺组织内的复制出现显著降低,且不会引起任何肺部病理及炎症反应。但是,滴鼻注射HIS可在小鼠局部肺组织引起短暂而显著的干扰素反应。这种干扰素反应可有效的激活体内T细胞的免疫响应,并可诱导记忆性T细胞的产生。最后,以恶性黑色素瘤为例,我们进一步展示了HIS可诱导肿瘤细胞内干扰素系统的上调及肿瘤细胞的死亡。同时,瘤内注射HIS表现出明显的肿瘤抑制效果。不仅可显著减缓注射处肿瘤的增长,也可通过激活免疫应答影响非注射肿瘤的增殖。研究结论1.我们首创了一种结合高通量方法学、正向遗传学与反向遗传学的系统生物学方法,可同步研究流感病毒所有单核苷酸突变的表型;2.我们新发现并验证了分布于A型流感病毒PB2、PB1、PA、M1等多个病毒蛋白的近30种不同的干扰素敏感突变;3.构建了高干扰素敏感的多点突变病毒株(Hyper Interferon Sensitive,HIS),并在多种细胞体系中验证了其干扰素敏感及干扰素诱导的表型。4.HIS在小鼠内使用安全,在正常组织中无可检测的病毒复制,但可引起局部暂时干扰素反应,诱导T细胞活化。5.在小鼠黑色素瘤系统中,瘤内注射HIS可直接抑制肿瘤进展。