研究背景及目的：钙离子通道是一种电压门控、亲水性、Ca2+离子选择性通透的孔道蛋白。心肌细胞膜上存在着两种不同电流特性的的钙通道:L型、T型。与T型钙通道相比,L型钙通道具有大电导、高电压激活、长时间开放,能和多种拮抗剂作用的特点。就功能而言,L型钙通道电流(ICa-L)不仅参与心肌动作电位平台期的形成和维持,在心肌兴奋一收缩偶联中起着极为重要的作用,而且,由心肌细胞膜上L型Ca2+通道激活而引发的Ca2+内流是触发肌质网贮存Ca2+释放(calciuminduced calcium release,CICR)、调控细胞内信号转导和基因表达的重要始动因素。L型钙通道由至少4个亚单位组成,包括α1,β,α2/δ。其α1亚单位由4个同源性跨膜结构域组成,以近似对称的方式排列,包含有感受膜电位变化的电压感受器、决定通透离子种类的选择性滤器和各种已知的被第二信使、药物和毒素作用的结合位点等,是Ca2+通道的主要功能亚基。因此,Ca2+通道药理学、电生理学的差异主要取决于α1亚基的种类。　　目前已知,在哺乳类组织,编码L型Ca2+通道α1亚基的基因有4种,根据组织来源分别称作α1S,α1C,α1D和α1F,对应于基因命名法,分别称Cav1.1,Cav1.2,Cav1.3,Cav1.4。Cav1.1(α1S)的表达仅限于骨骼肌,Cav1.4(α1F)则只局限于视网膜表达。Cav1.2(α1C)以心血管系统的分布占优势,而Cav1.3(α1D)则被认为主要表达于神经元和神经内分泌细胞。长期以来,人们一直认为在心脏生理和病理生理活动中起作用的L型Ca2+通道以及Ca2+通道阻断剂对心脏疾病的治疗作用的实现对象均是Cav1.2通道蛋白。然而,近年来这种观点受到一系列实验证据的挑战。Takimoto、Mangoni等分别在大鼠、小鼠和人的心肌组织中证实了Cav1.3通道RNA的存在,但集中表达于心房肌而非心室肌。与Cav1.2相比,Cav1.3通道被激活的膜电位更偏向于超极化方向(约有10mV的偏移)。这种特性允许Cav1.3钙通道参与心肌起搏组织的舒张期去极化。而Namkung等、Stefan等以及Zhang等报道,在编码Cav1.3钙通道的基因敲除小鼠,其显著的表型不仅有听力缺失,而且有明显的窦性心动过缓和房室传导阻滞,心肌L型ca2+电流的密度较野生型小鼠减少79％。这提示,Cav1.3在构成窦房结L型Ca2+电流中占有重要地位,对通常认为L型Ca2+通道仅在窦房结舒张期去极化仅起很小作用的观点提出质疑。Cav1.2型钙通道主要分布在工作心肌(心室肌和心房肌),而Cav1.3型钙通道主要分布在传导组织(窦房结、房室结)及心房,这种分布上的差异与其各自功能也基本相一致。上述提示,Cav1.3钙离子通道在心脏发挥着有别于Cav1.2的生理功能。然而,心肌细胞L型钙通道为什么有Cav1.2和Cav1.3两种基因编码,两者显著的分布和功能差异有何意义?Cav1.3是否具有与Cav1.2相似的调节通路?是亟待解决的问题。　　本实验室在前期工作中利用位于胞内的全长C端Cav1.3作为诱饵,用酵母双杂交方法在人心脏cDNA文库中筛选到一种新型相互作用蛋白,初步鉴定证实,该蛋白属于与SNARE复合体结合的小分子蛋白Snapin蛋白。已知该蛋白在神经系统作为囊泡运输融合相关蛋白复合物的相互作用蛋白,介导与神经递质释放有关的膜泡运输过程。我们的问题是:利用酵母系统筛选到的Snapin是否在哺乳类细胞,尤其是心肌细胞中与Cav1.3通道存在相互作用,这种相互作用对Cav1.3钙通道功能的影响是何?本实验旨在利用分子生物学、细胞生物学和生物化学分析结合实用膜片钳技术等,进一步确认Cav1.3钙通道与snapin蛋白的相互作用以及二者相互作用对通道功能的影响。为理解Cav1.3钙通道功能调节的途径,深入研究心肌钙离子通道的生理和病理生理作用,设计特异性药物作用的靶点提供新思路。　　方法:1.动物样品制备:从大鼠、小鼠及人的心房组织中提取蛋白。以IP buffer或者RIPA裂解液裂解组织,提取目的蛋白。单个心肌细胞由主动脉插管逆行灌流酶解消化分离小鼠心肌获得。2.细胞培养及载体构建与扩增:构建不含GFP的哺乳动物细胞表达载体pCDNA3.1-His-Myc(-)-snapin。扩增以下质粒备转染用pCMV6b-α1D、p91023(b)-β2a、pIRES2-EGFP、pCDNA3.1(-)-snapin、pIRES2-EGFP-snapin。消化传代培养人胚肾上皮细胞(HEK293),在含10％胎牛血清、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的Dulbecco’s modified Eagle’s(DMEM)培养液,放置于37℃,5％CO2的细胞培养箱中培养。待细胞长到70％~80％密度左右时,用胰酶消化传代,培养皿中细胞密度控制在2×105细胞/cm2左右。参照LipofectamineTM2000试剂盒说明书或用磷酸钙转染法,分别转染以下各种质粒:pCMV6b-α1D、p91023(b)-β2a、pCDNA3.1(-)、pIRES2-EGFP、pCDNA3.1(-)-snapin、pIRES2-EGFP-snapin。3.免疫共沉淀:组织或细胞蛋白裂解液中加入适当抗目的蛋白的抗体或者用于阴性对照的同源无关抗体,4℃孵育过夜,随后加入prteinG-Sepharose4℃摇晃4~8h。然后在免疫沉淀复合物中加入上样缓冲液,99℃煮样5min,用SDS-PAGE凝胶电泳western blot检测相关蛋白。4.免疫细胞化学:4％多聚甲醛固定酶解消化分离的新鲜心房肌细胞或转染48~60h后的HEK293细胞,3％牛血清白蛋白封闭,加入一抗4℃孵育过夜。双重免疫细胞化学荧光标记,荧光显微镜观察蛋白的定位情况。5.ICa-L的记录:用全细胞膜片钳记录技术在外源表达Cav1.3和snapin的HEK293细胞中记录ICa-L。比较分析单独表达Cav1.3和共表达Cav1.3和snapin情况下所记录ICa-L的差异。　　结果:1.无荧光的哺乳表达载体pCDNA3.1-His-Myc(-)-snapin的构建为进行双重免疫荧光标记实验,我们将得到的质粒pIRES2-EGFP-snapin用EcoRI、XhoI双酶切,同时将不带荧光的哺乳动物表达载体pCDNA3.1-His-Myc(-)用此二酶双酶切,T4连接酶16℃将纯化后的两种酶切产物连接过夜,转化,在氨苄抗性的LB固体培养板上生长出来的单克隆,摇菌,提取质粒,酶切初步鉴定后,送测序检验,结果成功构建了不带荧光的哺乳动物细胞表达质粒pCDNA3.1-His-Myc(-)-snapin。2.组织中膜蛋白的提取和Cav1.3和snapin的Western检测Western blot检测小鼠心房组织裂解液中的Cav1.3和snapin蛋白的表达,其中Cav1.3是易解聚的膜蛋白,通常在240KDa处和约120KDa处得到两个目的条带。而Snapin分子量为15KDa。3.Cav1.3与snapin两种蛋白在细胞的共定位共表达Cav1.3和snapin两种蛋白的HEK293细胞和酶解消化分离的新鲜心房肌细胞,都对Cav1.3和snapin的抗体有免疫阳性反应,其中Cav1.3主要分布在膜上,而snapin则在膜上和胞质中都可见,两种蛋白共定位于细胞膜。(见图3,4)4.免疫共沉淀证实Cav1.3和snapin两蛋白的相互作用在小鼠及大鼠心房组织裂解液和共转染Cav1.3和snapin的HEK293细胞裂解液中进行免疫共沉淀实验,分别以snapin的抗体免疫共沉淀Cav1.3和以Cav1.3的抗体免疫共沉淀snapin,结果说明两者能够相互形成免疫共沉淀复合物,提示Cav1.3钙通道蛋白与snapin蛋白间相互作用(见图5-7)。5.snapin在HEK293细胞中对ICa-L的影响与单独表达Cav1.3通道蛋白相比,在共表达Cav1.3和snapin蛋白的HEK293细胞记录的ICa-L密度显著减小(图8A)。而且,Snapin使Cav1.3钙通道激活和失活速度加快。经Bolzman方程计算分析结果显示,在Snapin和Cav1.3共表达的条件下,钙通道半激活电压(V1/2)向左偏移约2mV(图8 B),失活曲线向左偏移约1.4 mV(图8C)。但是,与单独表达Cav1.3相比,差异没有显著性。　　小结:1.在酵母双杂交体系中具有相互作用的Cav1.3钙通道蛋白与snapin蛋白,在心房肌细胞和外源表达这两种蛋白的HEK293细胞也有结合,而且两者在细胞膜上存在共定位。2.Snapin通过与Cav1.3的相互作用,不仅显著减小ICa-L密度,而且加速通道的稳态激活和失活过程。