人S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶原核表达及非放射性酶活性检测体系的建立及应用

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目的:以人体细胞普遍存在的多胺合成通路的关键酶S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶为研究对象,初步探索利用PEPC-MDH法检测人S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶酶活性的可能性,并从多方面验证和优化,以期解决目前人S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶抑制药物高通量筛选方式单一且操作复杂的问题,进一步为以AdoMetDC为靶标的抗肿瘤药物的高通量筛选提供一种简捷的,非放射性的方法。  方法:(1)在NCBI基因库中寻找人S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶序列,并将所得质粒的AdoMetDC基因测序后与之进行序列比对。(2)利用所得原核表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)并表达目的蛋白,并利用亲和层析,分子筛等获得较高纯度的目的蛋白。(3)利用所得蛋白进行体外酶促反应,并与PEPC酶法耦联后利用酶标仪在340nm波长下检测吸光值的变化,间接反映目的蛋白的酶活性。(4)在以上实验基础上,利用一种已知的AdoMetDC抑制剂MGBG,来检测此方法是否能够被用来检验抑制剂的作用。(5)利用此方法探索空气中CO2,酶促反应底物浓度,抑制剂浓度和反应时间对本体系的影响,并得到最佳值,并提高稳定性,使之能够用于高通量的筛选。(6)初步利用此方法筛选本实验组利用计算机模拟并购买小分子化合物。(7)利用NADH在340nm的激发和在425nm发射的特性,在荧光酶标仪上进一步验证本方法。  结果:(1)成功构建原核表达质粒并表达纯化出高纯度的人S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶蛋白。(2)人S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶与PEPC-MDH法相耦联的酶促反应实验证明纯化所得AdoMetDC具有一定的催化活性,可以用于接下来的实验。(3)优化实验证明外源性的CO2对本系影响较小;各反应物最优浓度为:S-腺苷甲硫氨酸的浓度为1mM,MGBG的最高浓度为100mM,反应时间段为0-5分钟。(4)实验结果所显示的稳定性较好,能够满足抑制剂高通量筛选要求。(5)利用我们建立和完善后的体系筛选小分子化合物,并得到一种具有一定抑制力的抑制剂。(6)NADH的荧光特性能够被用于本实验的补充方法,但有待进一步探索。  结论:本研究成功得到一定纯度的人S-AdoMetDC体外重组蛋白,并从多方面优化并建立了一种非放射性的人S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶活性检测的新方法。初步将此方法用于AdoMetDC抑制剂的筛选,并得到一种有一定抑制作用的小分子抑制剂。为人S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶抑制药物的高通量筛选提供了一种可供选择的新方法。为以多胺代谢通路为靶标设计抗肿瘤药物的研发提供了新的参考。
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