人乳头瘤病毒(Human Papillomavirus,HPV)被证实是与癌症关系最为密切的病毒病原体。全球每年由HPV感染所致癌症病例(包括女性宫颈癌,阴道癌,男性阴茎癌)达到56万例,约占全球全部癌症新发病例的5%。而在中国,每年约有10万的妇女因HPV感染而导致宫颈癌。通过对HPV致病机制的研究发现,与恶性肿瘤高度相关的高危型HPV多达15种。要彻底消除HPV所致癌症就必须能够同时预防这15种高危型HPV的感染。虽然目前已有2种重组HPV L1类病毒颗粒(Virus-Like Particle,VLP)疫苗上市,但是这两种疫苗均只能对HPV16/18两种高危型感染提供保护,而HPV16/18感染所致肿瘤仅占所有HPV感染所致肿瘤的60-70%。因此,下一代HPV疫苗研制所面临的重大挑战在于如何扩大疫苗保护型别。目前,扩大HPV疫苗保护型别范围的策略之一是增加疫苗中所包含HPVVLP型别,但是由于疫苗中蛋白种类的增加将会带来抗原之间相互干扰,工艺难度加大,不良反应增加等等一系列难以克服的问题,因此其扩增范围有限。另一更为行之有效的策略即为通过构建具广谱中和表位的杂合VLP,从而达到使用少数几种VLP即可提供对于多种HPV保护的目的。广谱杂合HPV VLP研制的技术关键在于如何将杂合HPV L1蛋白组装为构象正确的HPV VLP。因此,本研究尝试在不同型别间进行杂合VLP的组装,并对杂合VLP的组装条件与性质进行研究,进而研究HPVL1蛋白形成VLP的组装机制,探索L1上的广谱中和表位和型间的交叉保护,对广谱HPV疫苗的可行性进行初步探讨。首先在本研究中,将不同型别的HPVL1蛋白C175和C428位点分别进行突变,分别进行表达并经2步的层析制备了纯度能够达到95%以上这两类的突变蛋白,通过电镜观察,HPSEC和AUC检测,证实这些突变蛋白各自组装都不能形成VLP。但是在进一步的研究发现,C175和C428位点突变的蛋白通过混合共组装可以形成杂合VLP。通过比较以及对组装条件和比例的摸索,发现C175A和△C428两种突变蛋白组装杂合VLP组装率高且结构均一,同时确定最佳的组装缓冲液的pH为6.5,C175A和△C428两种突变蛋白的最优的组装比例为1:1。其次,在更多型别,真核表达系统的杂合组装中都获得了大量的,均一的杂合VLP。同时还发现,在有L2蛋白存在的条件下,杂合VLP具备了与野生型VLP相同的包裹外源基因可形成具感染能力的假病毒的能力。进而,在展示了外源肽段的突变蛋白之间也实现了杂合组装,获得了杂合VLP。接着,对杂合VLP的颗粒性进行检测评价,并结合低温电镜的三维结构重建证实了杂合VLP是多型别间比例固定、结构均一、形态与野生型VLP相似但粒径略大T=7的二十面体VLP;通过SDS-PAGE与双抗夹心ELISA实验证实了杂合VLP中2种突变蛋白的组成比例为1:1(n:n);比较发现,杂合VLP比野生型混合VLP具有更均一的结构和固定的化学计量比;DSC检测结果表明,杂合VLP的热稳定性介于五聚体和野生型VLP之间。最后,通过比较发现杂合VLP的抗原性与相应型别野生型VLP不同,大部分针对野生型VLP的构象抗体与杂合VLP的反应性下降。而动物试验考察免疫原性的结果显示,杂合VLP疫苗所诱导的针对相应型别的抗体水平不但与由相应型别野生型VLP所组成的多价疫苗所诱导的抗体水平相似,而且杂合VLP疫苗诱导交叉保护性的能力较多价疫苗更强。综合上述结果,本研究发现了在不同型别,不同表达系统中的广泛的适用的在HPV多型别间形成的杂合VLP的组装方式,并证实了在该条件下组装的杂合VLP中各组分比例固定,结构均一,并与野生型VLP具有相似的形态结构,并证实了其独特的抗原性和广谱的免疫原性。证实了构建具广谱中和表位的杂合VLP的可行性,并初步验证了其具备广谱保护性的特性,提示杂合VLP可以成为下一代新型HPV疫苗候选。这些工作将为野生型HPV的衣壳形成,基因组的包装,广谱表位等研究奠定了理论基础,为HPVL1蛋白的分子设计与改造提供参考,并为下一代的新型HPV疫苗研发提供新的思路。