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烟草是我国的一种重要叶用经济作物。烟草上部叶共6～8片,约占整株烟叶叶片数1/3,占单株烟叶总重量的40%左右,对烟叶产量有较大的贡献。而我国多数烟区由于上部叶生长发育不良、开片不充分,导致叶片结构紧密、烟碱含量过高、化学成分不协调,严重影响了上部烟叶的质量和可用性,造成上部烟叶大量积压。因此,研究烟草上部叶生长发育,促进上部叶开片以提高上部烟叶可用性是当前的研究热点和难点。本研究基于烟草杂交种选育利用,以增强烟草上部叶开片的相关性状的杂种优势为目标,选取上部叶叶面积差异较大的8个烤烟品种(系)为亲本,采用NCⅡ遗传交配设计组配了16个杂交组合,选择光照、温度、海拔等生态因素不利于上部叶生长发育的威宁县种植亲本及其杂交组合;通过对上部叶叶面积及其相关性状测定结果的相关分析,明确了与上部叶叶面积大小密切相关的单位性状,探讨了烟草上部叶叶面积相关性状的杂种优势表现,筛选出杂种优势表现差异大的杂交组合;采用实时荧光定量技术,在基因表达水平上分析了上部叶叶面积相关性状调控关键基因的相对表达量及其与杂种优势的关系,初步探明了调控烟草上部叶叶面积杂种优势的关键基因。主要研究结果如下:1、烟草上部叶叶面积及其相关性状的表现:不同材料上部叶叶长、上部叶叶宽的变化规律基本一致,打顶后第7d到第28d是其上部叶叶长、上部叶叶宽发生最明显变化的时期,第7d后增长速度相对较快,说明上部叶叶长、上部叶叶宽主要变化时期从打顶后7d开始。参试材料间的上部叶叶长、叶宽、叶面积等性状差异达显著或极显著水平,8个亲本中,开片最好的毕纳一号的上部叶叶长(64.05cm)、叶宽(17.72cm)、叶面积(724.45cm~2)与开片最差的NC82的上部叶叶长(48.67cm)、叶宽(13.34cm)、叶面积(430.25cm~2)的差异达到极显著,且差异较大;16个杂交组合中,开片最好的Va116×毕纳一号的上部叶叶长(62.52cm)、叶宽(16.17cm)、叶面积(644.45cm~2)与开片最差的NC82×韭菜坪2号的上部叶叶长(43.20cm)、叶宽(12.11cm)、叶面积(345.28cm~2)的差异达到极显著,且差异较大。结果说明参试亲本及杂交组合材料间的上部叶叶面积及其相关性状表现出较大的差异,有广泛的遗传基础,研究选择的亲本适宜。2、烟草上部叶叶面积及其相关性状的配合力分析:配合力方差分析结果显示,自然株高、打顶后株高、上部叶叶长、上部叶叶宽和上部叶叶面积等5个性状在母本间的差异达到了显著或极显著水平,在父本间的差异未达到显著水平;且6个性状在父本与母本间的互作效应均达到了显著或极显著水平。说明供试材料在被测性状中存在着真实的配合力差异,且父母本间的互作效应的差异也达到了显著水平,从8个亲本的GCA分析结果可以看出,以毕纳一号在6个性状中的GCA综合表现较好,在叶片数(0.36)、上部叶叶长(5.00)、上部叶叶宽(0.72)和上部叶叶面积(68.87)4个性状均表现出较高的GCA正效应值,自然株高(-0.35)和打顶后株高(-5.43)的GCA表现为负效应,说明毕纳一号是育种过程中降低株高、增加叶片数、增加上部叶叶长和上部叶叶宽的优良供体。G28×韭菜坪2号和Va116×韭菜坪2号上部叶叶长、叶宽和叶面积表现出较高的SCA。因此,G28×韭菜坪2号、K326×GDH88和Va116×韭菜坪2号在以提高烟草上部叶叶面积相关性状为育种目标的杂种一代选育中有重要的利用价值。3、烟草上部叶叶面积的相关性状分析:2016年参试材料上部叶叶面积与上部叶叶长、上部叶叶宽等性状相关分析结果显示,上部叶叶面积与上部叶叶长、上部叶叶宽的相关极显著,相关系数分别为0.89、0.94;与自然株高、打顶后株高、叶片数的相关不显著。2017年验证试验的结果显示,上部叶叶面积与上部叶叶长、上部叶叶宽的相关极显著,相关系数分别为0.8、0.9;与自然株高、打顶后株高、叶片数的相关不显著。综合两年试验结果,筛选上部叶叶长、上部叶叶宽性状作为上部叶叶面积密切相关的性状。4、基因差异表达分析材料的筛选:各组合间上部叶叶面积中亲优势差异较大,16个杂交组合中,G28×韭菜坪2号(19.37%)和Va116×韭菜坪2号(13.80%)的中亲优势最高,K326×韭菜坪2号(-20.11%)和NC82×韭菜坪2号(-32.16%)中亲优势最低。可将G28×韭菜坪2号和Va116×韭菜坪2号作为强优势材料,K326×韭菜坪2号和NC82×韭菜坪2号作为弱优势材料进行基因差异表达分析。5、烟草叶面积相关性状杂种优势的差异表达关键酶基因分析:4个调控叶长、叶宽的关键基因在不同组合间的相对表达量有明显差异,GRXC9、LNG1、ROT3基因在强优势杂交组合G28×韭菜坪2号中的相对表达量明显高于弱优势杂交组合。叶长、叶宽关键基因相对表达量与杂种优势相关性分析表明,在打顶当天,调控叶片长度的GRXC9和LNG1基因的相对表达量影响了上部叶叶长杂种优势的形成,LNG1基因的作用强于GRXC9基因,GRXC9、LNG1、ROT3基因相互之间达到极显著正相关,存在互作效应,说明GRXC9和LNG1基因在调控上部叶叶长杂种优势中涉及到ROT3的间接影响;调控叶宽的关键基因AN3与叶宽杂种优势未到显著性相关。在打顶后第7d,LNG1基因的表达负向调控上部叶叶长杂种优势的形成,ROT3基因的表达正向调控上部叶叶长杂种优势的形成。由两个时期基因差异表达分析结果来看,基因表达量和杂种优势表现不一致,在不同组织和发育阶段,有不同的基因参与到杂种优势的形成。而两个时期调控叶宽的关键基因AN3与上部叶叶宽杂种优势均未到显著性相关。本研究未筛选到与调控上部叶叶宽杂种优势的基因。